[发明专利]水稻淀粉分支酶SBE3基因的人工定点突变体及其应用

权利要求书

1.水稻淀粉分支酶SBE3基因的第8外显子的突变序列，其特征在于，所述突变序列的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 2所示。

2.根据权利要求1所述的突变序列，其特征在于，所述突变序列通过采用CRISPR/Cas9基因靶向修饰技术对野生型SBE3基因的第8外显子进行修饰使得所述第8外显子的碱基发生缺失而得到，其中对野生型SBE3基因的第8外显子进行修饰的靶向序列位于所述第8外显子中的第70-89位碱基。

3.一种水稻淀粉分支酶SBE3基因的突变基因，其特征在于，相对于野生型SBE3基因，所述突变基因的第8外显子为权利要求1或2所述的突变序列。

4.一种载体，其包含权利要求1或2所述的突变序列或者权利要求3所述的突变基因。

5.权利要求1或2所述的突变序列、权利要求3所述的突变基因或者权利要求4所述的载体在含高抗性淀粉水稻品种的育种中的用途。

6.表达载体pCAMBIA1300::SBEIIbsgRNA::Cas9，所述表达载体如下构建得到：

以如SEQ ID NO. 3所示的野生型水稻淀粉分支酶SBE3基因序列中第8外显子中的第70-89位碱基为靶向序列，合成如SEQ ID NO. 5所示的寡核苷酸作为上游引物，合成如SEQID NO. 6所示的寡核苷酸作为下游引物；

用BbsI酶切sgRNA载体OsU6-SK质粒载体后，胶回收；将所述上游引物和下游引物分别加入ddH2O中，稀释成10μmol母液，分别吸取10μl放到同一个管中，放入PCR仪，退火获得带接头的双链DNA片段；将所述双链DNA片段与载体的胶回收产物连接过夜，连接产物转化DH5α大肠杆菌，鉴定阳性克隆并验证构建得到正确的OsU6-SbeIIbsgRNA-SK载体；

用KpnI和SalI同时双酶切构建好的OsU6-SbeIIbsgRNA-SK载体和35S-Cas9-SK质粒载体，胶回收OsU6-SbeIIbsgRNA-SK片段，将回收后的OsU6-SbeIIbsgRNA-SK片段与回收后的线状35S-Cas9-SK质粒载体过夜连接，连接产物转化DH5α大肠杆菌，鉴定阳性克隆并验证构建得到正确的OsU6-SbeIIbsgRNA-35S-Cas9-SK载体；

用KpnI和EcoRI双酶切OsU6-SbeIIbsgRNA-35S-Cas9-SK载体，回收OsU6-SbeIIbsgRNA-35S-Cas9片段；同时用这两种酶双酶切pCAMBIA1300质粒表达载体，然后胶回收；将分别胶回收的片段与pCAMBIA1300载体过夜连接，连接产物转化大肠杆菌，鉴定阳性克隆并验证构建得到正确的表达载体pCAMBIA1300::SBEIIbsgRNA::Cas9。

7.权利要求6所述的表达载体pCAMBIA1300::SBEIIbsgRNA::Cas9在水稻品种的育种中的用途。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述水稻品种为高抗性淀粉水稻品种。