[发明专利]水稻淀粉分支酶SBE3基因的人工定点突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种水稻淀粉分支酶SBE3基因人工定点突变体及其应用。所述水稻淀粉分支酶基因人工突变体通过采用CRISPR/Cas9基因靶向基因编辑技术对SBE3基因第8外显子修饰，使得第8外显子的碱基发生缺失而得到。本发明采用CRISPR/Cas9对SBE3基因的第8外显子进行人工突变，并筛选出抗性淀粉含量显著提高且通过后代分离去除筛选标记的的突变体水稻植株，抗性淀粉含量达到10％以上。

技术领域

本发明涉及水稻基因组编辑育种领域，具体地，本发明涉及水稻淀粉分支酶SBE3基因的人工定点突变体及其应用。

背景技术

抗性淀粉(Resistant Starch，简称RS)是指“在健康个体的小肠中不能被吸收的淀粉或淀粉降解产物”(欧洲RS协会EURESTA定义)。已有研究表明，抗性淀粉不能在小肠中被消化吸收和提供葡萄糖，在大肠中则可以被生理性细菌发酵，产生短链脂肪酸(Shortchain fatty acids，SCFA)和气体。抗性淀粉有着重要的生理功能，包括降低餐后血糖和胰岛素应答，提高机体对胰岛素的敏感性，预防便秘和结肠癌的发生，降低血清中胆固醇和甘油三酯含量，降低和控制体重，促进矿物质吸收。与低抗性淀粉饮食者相比，高抗性淀粉饮食者具有较少的胰岛素反应，这对糖尿病患者控制餐后血糖值有很大影响，尤其对于非胰岛素依赖型病人，摄食高RS食物，可延缓餐后血糖上升，有效控制糖尿病病情。

通过筛选和鉴定高RS含量的水稻遗传资源来改善人们的饮食结构，是治疗和预防糖尿病等文明病发病的最经济有效的手段之一。上海市农业科学院作物栽培育种研究所利用化学诱变和小孢子培养技术并结合常规育种技术，培育了高RS粳稻新品种“降糖稻1号”，并与相关企业合作进行了产业化开发，缓解了糖尿病人吃饭难、吃不饱饭的难题，该产品商品名为“优糖米”。课题组还首次以降糖稻1号及籼稻密阳23杂交后代为定位群体，定位分离克隆了控制水稻高抗性淀粉性状形成的主效基因sbe3-rs，并对其进行了功能互补验证，证明sbe3-rs是水稻淀粉分支酶SBE3基因的突变基因。而高抗性淀粉含量水稻品种降糖稻1号具有水稻淀粉分支酶SBE3基因的突变基因，具体为SBE3基因第16个外显子的第105位发生碱基T-C的突变，此突变是化学诱变结合小孢子培养技术产生的，该突变是随机发生的。

近年来，基因组编辑技术蓬勃发展，其可以实现对靶位点的定点突变、缺失、插入或替换，已经广泛用于各自植物或作物的基因组修饰中。但是，对于水稻高抗性淀粉性状、特别是针对水稻高抗性淀粉性状形成的主效基因SBE3，目前尚未有这方面的相关研究或成果。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明的发明人考虑可以使用新的基因组编辑技术CRISPR/Cas9体系对水稻野生型基因SBE3进行人工突变，由此定向快速获得新型突变体材料，以便筛选出包含人工定点突变从而抗性淀粉含量得到显著提高的新型水稻品种。

因此，本发明的一个目的是通过采用CRISPR/Cas9基因靶向修饰技术，提供野生型水稻淀粉分支酶SBE3的人工定点突变体及其相关序列与载体。

本发明的另一个目的是提供所述人工定点突变体及其相关序列与载体在含高抗性淀粉水稻品种的育种中的用途。

本发明的技术方案如下。

一方面，本发明提供一种水稻淀粉分支酶SBE3基因的第8外显子的突变序列，所述突变序列相对于野生型SBE3基因的第8外显子缺失一个或多个碱基。

本发明提供的突变序列通过采用CRISPR/Cas9基因靶向修饰技术对野生型SBE3基因的第8外显子进行修饰使得所述第8外显子的碱基发生缺失而得到。

其中，野生型水稻淀粉分支酶SBE3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，其第8外显子如SEQ ID NO.3所示。