[发明专利]一种利用纳米通道技术检测癌症的方法

说明书

技术领域

本发明属于纳米通道基因测序技术领域，具体涉及一种利用纳米通道技术检测癌症的方法。

背景技术

纳米通道检测技术是将α溶血素插入脂质双分子层中形成天然的纳米通道，纳米通道与两个流体池相连，对纳米通道两端电极施加电压时，可以产生一个恒定的基准离子电流。当核酸序列通过时，由于物理占位，将会改变纳米通道的电阻，电阻的变化将导致离子电流的变化，形成类似方波信号的调制电流。调制电流的波形与生物分子的物理信息直接相关，分析方波信号的幅度、持续时间，就能辨识核酸序列长度和类别，这可视为一种天然探测单分子的传感器（见图1）。microRNA发挥着致癌或者抑癌的作用，通过转录后调节机制，参与机体生理和病理过程，与肿瘤的发生、发展、转移及预后相关，可作为癌症的生物标志及治疗预后指标。利用纳米通道检测技术检测microRNA被认为是检测癌症领域的新发展方向之一，一旦获得实质性突破将会给医学检测带来一场技术性革新。本发明基于纳米通道检测技术，为快速、准确、低成本实现癌症早期诊断提供新的方法，以填补该项目研究领域的空白。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用纳米通道技术检测癌症的方法，通过检测癌症相关的microRNA标志物，实现癌症的早期检测。本发明提供详细的实验步骤以及最佳发应条件，以填补该项目研究领域的空白。本发明所采取的技术方案如下。

一种利用纳米通道技术检测癌症的方法，该方法需要用到一种样品池，样品池分为cis和trans两个隔室（B，B'），隔室之间由120 -159μm的 Toflon薄膜隔离开。孔A与孔A'是用来第一次加液体和插入电极的，通过电极与膜片钳相连，将化学信号转化为电信号，之后液体的加入从下面孔C和孔C'操作。该方法包括以下步骤：

（1）在腔室B和腔室B'中分别放入磁子，然后分别从孔A和孔A'中注入超纯水，以液面高于微米孔为准，计算出所需超纯水的体积2mL；

（2） 取出磁子，倒出超纯水，并反复冲洗Toflon薄膜、腔室及孔洞，最后用无水乙醇冲洗；

（3）冲洗干净后，用氮气将腔室内以及Toflon薄膜上残留的液滴吹干；

（4）然后，在Toflon薄膜两边靠近微米孔处分别滴上一滴约10~15μL H液，并迅速吹开，使其在膜上延展散开。其中，H液为1mL戊烷与100μL十六烷的混合液；

（5） 在腔室B和腔室B'中分别放入磁子，然后，从孔A和孔A'分别用移液器加入0.8~1.1mL 含10 mmol/ L Tris和1 mol/ L KCl缓冲液，再分别插入Ag/AgCl电极；

（6）然后，孔A的电极与探头的trans端相连，孔A'的电极与探头的cis端相连；

（7）用25μL的微量移液器分别在腔室B和腔室B'中加入15~25μL L液，使L液在液面上均匀地铺开，然后等待30s-1min。其中，L液为25mg磷脂与2.5mL戊烷的混合液迅速轻吹；

（8）从孔C和孔C'的中分别再加入0.8~1.1mL 的10 mmol/ L Tris缓冲液，观察是否形成磷脂双分子层，如形成，则进行后续实验；如未形成，则从孔C和孔C'端反复吹打几次，直至其形成磷脂双层；

（9）在形成磷脂双分子层后，对系统施加电压+180 mV~+200 mV，在孔B'中加入α-溶血素溶液其终浓度为0.0125~0.145ng/mL，并开启孔B'的搅拌系统，控制合适的转速，搅拌约2min，形成纳米单通道；

（10）形成纳米通道后，在孔B'中加入一定量的microRNA，开启搅拌系统，搅拌约5s后，开始收集检测信号。

经验证，采用本方法可以简单、快速的检测出肿瘤生物标志物microRNA，并可根据其阻塞时间、电流幅度等判断出microRNA的种类。

附图说明

图1纳米通道技术原理示意图。

图2 样品池结构示意图。

图3 纳米通道检测Mir-31：(左)典型的单通道信号记录 (右)对应的散点图。

图4 不同的核酸样品与平均阻滞时间图。

图5 纳米通道检测Mir-31：(左)典型的单通道信号记录 (右)对应的散点图。

图6 不同浓度Mir-31的电流振幅直方图与浓度曲线图。

具体实施方式

下面以乳腺癌为例对本发明做进一步的解释说明。

介绍具体实施例前，对本发明所用到的主要仪器设备和试剂介绍如下。