[发明专利]食源性致病菌可视化检测探针及可视化检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及食源性致病菌检测技术领域，具体涉及一种食源性致病菌可视化检测探针及可视化检测方法。

背景技术

食源性致病菌的检测手段多种多样，可概括分为以下三大类：

1、传统的培养方法，通过细菌的选择性分离，将平板上肉眼可见的特征性菌落进行确认，并对该菌落分离物采用三糖铁琼脂、赖氨酸脱羧酶试验、蛋白胨水、尿素琼脂、氰化钾等进行生化试验和多价菌体抗原（O）、多价鞭毛抗原（H）等血清学检测，以最终做出鉴定。一般全过程需时至少4～7天，才能得出明确的诊断结果。虽然，此方法耗时繁琐，但因其成本较低且较为稳定，已作为检验检疫行业的金标准。

2、基于免疫学的检测方法，一般作为初筛方法，所检测出的阳性样品最终还需经过传统的培养方法进行进一步确证，并且受到环境因素影响较大，批次之间的结果可能差异较大，其检测灵敏度也往往较低。胶体金免疫层析技术在快速检测上有自身的优势，其方法得到了美国官定分析化学家协会（AOAC International）官方认可，能够对样品中的沙门氏菌、大肠杆菌O157等进行快速的检测。该法比起传统的培养法、ELISA等更加地快捷，但其灵敏度不如PCR方法，且基于免疫学方法的检测，受环境、样品基质等影响较大，只能作为一种初筛方法。

3、基于分子生物学的检测方法，本方法首先需要对检测样品进行核酸提取，即便有全自动核酸提取仪的应用，在进行大量样品的前处理过程中仍然有些繁琐，而且这种仪器价格昂贵，操作起来不够简单，应用起来有诸多不便。PCR技术在食源性致病菌检测是比较成功的，已开发出一系列商品试剂盒，如霍乱弧菌、沙门氏菌、志贺氏菌、蜡样芽胞杆菌、大肠埃希氏菌等PCR检测试剂盒，部分已经得到AOAC官方认可。除常规PCR技术外，多重荧光PCR技术的应用也日渐增加。

目前，检测食源性致病菌的方法虽有多种，但是在易操作、灵敏度等方面仍然存在一些不足：如需要贵重的仪器、繁琐的操作步骤、复杂的样品前处理、检测周期比较长、较高的假阳性、实际样品检测存在灵敏度不足等。尤其对于基层实验室，还停留在传统选择性培养方法对致病菌进行检测，缺少一种简便准确、高灵敏的快速检测技术。

因此，毋需繁琐的样品前处理，即能实现致病菌的快速、高灵敏、高特异性检测，且不需要贵重的仪器，能在基层实验室进行推广应用的快速检测方法成为了本领域研究的重点方向。若要解决上述问题需具备几个因素：1）样品的简化处理，无需进行核酸的提取与纯化；2）检测方法的高灵敏与高特异；3）能够同时检测多种致病菌；4）无需贵重仪器，能够在基层实验室开展相关工作。

2007年，Mitani 等在《Nature Methods》上报道了一种新型的等温扩增技术，即SmartAmp技术（Smart Amplification Process Technology），它采用5条引物和DNA错配结合蛋白（MutS）进行目标产物的扩增，能保证扩增产物的“绝对特异”，目前该技术主要用于单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphisms，SNPs）分型以及突变的检测。2013年，军事医学科学院刘雪林、宋宏彬等人发表了一篇介绍SmartAmp技术的综述，该文指出在食物、环境中病原体检测方法，虽然尚未见相关研究报道，但SmartAmp方法的原理同样适用。SmartAmp技术从样品的粗制备到扩增的结束，整个检测过程20～60分钟，不会出现非特异性，只要有扩增信号就表示目标物的存在，而且SmartAmp技术的扩增能力是普通PCR技术的100倍^[14,15]。其“绝对”特异性归功于引物设计的独特性（5条引物TP、FP、OP1、OP2、BP），而DNA错配结合蛋白（MutS）更是加强了扩增过程的绝对特异，而不会继续扩增造成非特异信号的出现。