[发明专利]一种细菌中细胞色素P450酶的制备方法及应用

权利要求书

1.一种细菌中细胞色素P450酶的制备方法，其特征在于，所述制备方法主要包括以下步骤：

a.冷冻-破碎处理：提供细菌培养液，所述细菌培养液的组成成分为：磺胺嘧啶：1-5mg/L，乙酸钠：1-3g/L，硝酸钠：0.1-0.2g/L，氯化铵：0.1-0.2g/L，磷酸氢二钾：0.05-0.1g/L，酵母浸粉：0.05-0.1g/L，溶剂为海水，将芽孢杆菌B-1接种于所述细菌培养液中，在温度为20-30℃、盐度为20-35‰、pH值为7.0-8.5的环境下培养7-16天，得到菌液，将菌液恒温离心获得菌体，菌体在-15℃~-20℃的温度下冷冻4-5h，然后在冰水浴下破碎处理，得到提取液；

b.浓缩透析：将上述提取液经0.22μm滤膜过滤去除破碎后的菌体残余细胞壁，再经聚乙二醇PEG20000浓缩，并用10mmol/L的磷酸钾缓冲液透析12-24h得到细胞色素P450酶粗品；

c.纯化：用10mmol/L，pH7.2的磷酸缓冲液对DEAE纤维素柱平衡后，将细胞色素P450酶粗品上样，用20mmol/L，pH7.2的磷酸缓冲液以4.5mL/min的流速洗脱；经聚乙二醇PEG20000浓缩后，用5mmol/L的磷酸缓冲液透析24h，用分子截留量为10000的超滤膜再次浓缩；用5mmol/L，pH7.2的磷酸缓冲液对MonoQ柱平衡后，将首次纯化后的细胞色素P450酶粗品上样，用20mmol/L，pH7.2的磷酸缓冲液以4.5mL/min的流速洗脱；用5mmol/L，pH7.2的磷酸缓冲液透析24h，用分子截留量为10000的超滤膜浓缩，干燥后制得细胞色素P450酶成品。

2.根据权利要求1所述的一种细菌中细胞色素P450酶的制备方法，其特征在于，所述细菌在细菌培养液中的接种量为2-5wt%。

3.根据权利要求1所述的一种细菌中细胞色素P450酶的制备方法，其特征在于，步骤a中所述菌液恒温离心的温度为3-8℃。

4.根据权利要求1所述的一种细菌中细胞色素P450酶的制备方法，其特征在于，步骤a中所述的破碎处理采用超声波破碎仪，所述超声波破碎仪的功率为1000-1200W，温度为10-20℃，频率为20-25KHz，10s/10s，时间为15-25min。

5.一种如权利要求1-4任一所述细菌中细胞色素P450酶的制备方法制成的细胞色素P450酶的应用，其特征在于，所述细胞色素P450酶用于降解磺胺类抗生素。

6.根据权利要求5所述的细胞色素P450酶的应用，其特征在于，所述磺胺类抗生素与细胞色素P450酶的质量比为（100-300）：1。