[发明专利]一种细菌中细胞色素P450酶的制备方法及应用

说明书

本发明涉及一种细菌中细胞色素P450酶的制备方法及应用，属于生物技术领域。该细菌中细胞色素P450酶的制备方法主要包括以下步骤：a.冷冻‑破碎处理：将菌液恒温离心获得菌体，菌体在‑15℃～‑20℃的温度下冷冻4‑5h，然后在冰水浴下破碎处理，得到提取液；b.浓缩透析：将上述提取液浓缩，经透析12‑24h得到细胞色素P450酶粗品；c.纯化：将细胞色素P450酶粗品经纯化后制得细胞色素P450酶成品。该制备方法提取率高，且制得的细胞色素P450酶纯度高、活性好，对磺胺嘧啶具有高效的降解效果，可以用于降解磺胺类抗生素。

技术领域

本发明涉及一种酶的制备方法及应用，尤其涉及一种细菌中细胞色素P450酶的制备方法及应用，属于生物技术领域。

背景技术

磺胺类抗生素具有疗效良好、使用方便、性质稳定、价格低廉等优点，在水产养殖的疾病控制中起着不可替代的作用。但是，同样由于其广泛使用，造成磺胺类抗生素对海水养殖生态环境造成严重破坏。

磺胺类抗生素的有效去除成为亟待解决的难题。目前，国内外关于利用生物降解抗生素的研究报道较少。张树清等发现高温堆肥对鸡粪中四环素类抗生素具有降解效果，且外源添加有益降解菌剂(芽孢杆菌)有助于抗生素药物残留的去除。Teruya等从海水鱼养殖场的淤泥筛选出能降解氨苄西林、强力霉素、氧四环素(土霉素)、甲砜氯霉素的菌株，经外形、分类学和16S rDNA分析鉴定，这些菌株为Flavobacterium-CytopHaga-Bacteroidesgroup和proteobacterial subdivisions。但少有关于利用生物降解磺胺类抗生素的研究报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中存在的上述问题，提出了一种纯度高、活性好的细菌中细胞色素P450酶的制备方法。

本发明的目的可通过下列技术方案来实现：一种细菌中细胞色素P450酶的制备方法，所述制备方法主要包括以下步骤：

a.冷冻-破碎处理：将菌液恒温离心获得菌体，菌体在-15℃～-20℃的温度下冷冻4-5h，然后在冰水浴下破碎处理，得到提取液；

b.浓缩透析：将上述提取液浓缩，经透析12-24h得到细胞色素P450酶粗品；

c.纯化：将细胞色素P450酶粗品经纯化后制得细胞色素P450酶成品。

在上述的一种细菌中细胞色素P450酶的制备方法中，步骤a中所述菌液的制备方法为：将细菌接种于细菌培养液中，在温度为20-30℃、盐度为20-35‰、pH值为7.0-8.5的环境下培养7-16天，得到菌液。

在上述的一种细菌中细胞色素P450酶的制备方法中，所述细菌为芽孢杆菌B-1。芽孢杆菌B-1可以降解磺胺嘧啶，细胞色素P450酶是其分泌的一种酶，可以氧化磺胺嘧啶的活性基团。

在上述的一种细菌中细胞色素P450酶的制备方法中，所述细菌培养液的组成成分为：磺胺嘧啶：1-5mg/L，乙酸钠：1-3g/L，硝酸钠：0.1-0.2g/L，氯化铵：0.1-0.2g/L，磷酸氢二钾：0.05-0.1g/L，酵母浸粉：0.05-0.1g/L，溶剂为海水。不同的细菌的培养方式，细菌中细胞色素P450酶具有不同的活性。在本发明的细菌培养液中进行培养的细菌，其细胞色素P450酶活性能够进一步得到提升。

在上述的一种细菌中细胞色素P450酶的制备方法中，所述细菌在细菌培养液中的接种量为2-5wt％。

在上述的一种细菌中细胞色素P450酶的制备方法中，步骤a中所述菌液恒温离心的温度为3-8℃。

在上述的一种细菌中细胞色素P450酶的制备方法中，步骤a中所述的破碎处理采用超声波破碎仪，所述超声波破碎仪的功率为1000-1200W，温度为10-20℃，频率为20-25KHz(10s/10s)，时间为15-25min。