[发明专利]一种同时检测多杀性巴氏杆菌及其荚膜A型双重实时荧光定量PCR方法的引物及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种同时检测多杀性巴氏杆菌及其荚膜A型的双重Real-time PCR方法的引物及应用。

背景技术

多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida，Pm)可引起人和动物的多种疾病，包括禽霍乱、牛出血性败血症、猪萎缩性鼻炎、兔出血性败血症和人的皮下感染等，对动物造成较高的致病率和死亡率。多杀性巴氏杆菌根据荚膜型的不同分为：A、B、D、E和F型。常规检测多杀性巴氏杆菌抗原的方法是采用细菌分离鉴定，或者增菌后通过普通PCR检测。其中，细菌分离鉴定法在实际操作中非常繁复，且易受杂菌干扰影响，这种方法耗时费力；而普通PCR方法相较于传统的分离鉴定检测法，虽然较为灵敏快捷，但是对目标菌在菌液中的含量以及杂菌数量等方面要求较为严格，且有可能出现假阴性与假阳性等结果。细菌荚膜的分型主要采用血清学方法和荚膜PCR分型：血清学方法需要荚膜型标准血清，很难购买到，费时费力。

发明内容

本发明的目的在于：过设计两对高特异性引物，采用Taqman实时荧光定量PCR方法同时对多杀性巴氏杆菌及其荚膜A型菌进行鉴定，从而替代普通PCR的方法，使检测更准确和高效。本发明设计两对高特异性荧光定量PCR检测引物，便于对多杀性巴氏杆菌及其荚膜A型菌的检测，从而提高检测效率。

本发明的一种同时检测多杀性巴氏杆菌及其荚膜A型双重实时荧光定量PCR方法的引物及应用，所述的引物包括上、下游引物和Taqman探针引物，具体如下：

上游引物Kmt-F：5'-GCTYGTTGTGAGTGGGCTTGT-3'；

下游引物Kmt-R：5'-GCCGTTGTCAAGGAAGCAGAT-3'；

探针引物Kmt-P：5'FAM-TTTGTTGGGCRGAGTTTGGTG-BHQ1 3'；

上游引物CapA-F：5'-GGGCTGGCTATGTTGGTTTAT-3'；

下游引物CapA-R：5'-CTTTATCTGTGATGGGCGATT-3'；

探针引物CapA-P：5'HEX-TAGCTCAACACCACAATGTGATCT3'。

本发明包含以下有益效果：

本发明通过Kmt引物检测多杀性巴氏杆菌，利用CapA引物检测该菌的荚膜A型。

本发明采用的高特异引物，使用荧光定量PCR法，在细菌含量在3×10^-12g/μL时仍可准确的检测出来多杀性巴氏杆菌及其荚膜A型，且不受杂菌干扰影响；采用的实时荧光定量PCR法检测多杀性巴氏杆菌抗原，具有方便、准确、高灵敏度的特点。

附图说明

图1为FAM探针标记(kmt1基因)和HEX探针标记(CapA基因)双重实时荧光定量PCR检测的标准曲线；其中A为kmt1基因曲线，B为CapA基因曲线；

图2为双重实时荧光定量PCR敏感性检测图；其中，N为阴性对照；

图3为常规双重PCR电泳图；其中，N为阴性对照；

图4为实时荧光定量PCR特异性检测图；其中，A为P.multocida C48-1荚膜A型(C apA)HEX；B为P.multocida C48-1FAM；C为P.multocida C44-1FAM；D为P.multoci da 901FAM；E为其它菌株。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式的一种同时检测多杀性巴氏杆菌及其荚膜A型双重实时荧光定量PCR方法的引物及应用，所述的引物包括上、下游引物和Taqman探针引物，具体如下：

上游引物Kmt-F：5'-GCTYGTTGTGAGTGGGCTTGT-3'；

下游引物Kmt-R：5'-GCCGTTGTCAAGGAAGCAGAT-3'；

探针引物Kmt-P：5'FAM-TTTGTTGGGCRGAGTTTGGTG-BHQ1 3'；

上游引物CapA-F：5'-GGGCTGGCTATGTTGGTTTAT-3'；

下游引物CapA-R：5'-CTTTATCTGTGATGGGCGATT-3'；

探针引物CapA-P：5'HEX-TAGCTCAACACCACAATGTGATCT3'。

具体实施方式二：

PCR反应体系为20μL；

PCR反应条件：95℃5min；95℃15sec，53℃20sec，72℃30sec，35循环；在循环的延伸时进行荧光信号检测。