[发明专利]一种重组人源溶菌酶的层析方法

说明书

本发明属于生物大分子的分离纯化领域，涉及一种重组人源溶菌酶的层析方法。本发明还包括该层析方法特定的层析介质。基于溶菌酶具有抗菌、消炎、抗病毒等重要作用，本发明利用新型阴离子/疏水复合填料介质，通过对介质平衡液、洗脱液组合方式等介质和方法的优化，直接从酵母菌发酵液中分离纯化重组人源溶菌酶，分离纯化后得到的溶菌酶蛋白纯度和活力分别可以达到99.0％和70000u/mg以上。本发明较现有技术的重组人源溶菌酶的生产方式，具有处理速度快，处理量大，工作量小，成本低的优点，适合工厂化大规模生产。

技术领域

本发明属于生物大分子的分离纯化领域，涉及一种重组人源溶菌酶的层析方法。本发明还包括该层析方法特定的层析介质。

背景技术

现有技术公开了溶菌酶(1ysozyme)是1923年由青霉素的发明者--英国著名科学家弗莱明在偶然机会中发现的一种天然抗菌物质，又称胞壁质酶(muramidase)或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶(N-acetylmuramide glycanohydrlase)，它属于碱性酶，能极大地水解致病菌中黏多糖。溶菌酶可水解肽聚糖中N.乙酰胞壁酸和N.乙酰葡萄糖胺之间的B2.1，4糖苷键，在渗透压作用下导致革兰氏阳性菌细胞壁破裂，从而发生重要的溶菌作用。它主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。因此，这种溶菌酶具有抗菌、消炎、抗病毒等重要作用。

目前重组人源溶菌酶的主要生产方式为酵母菌发酵表达分泌溶菌酶蛋白，然后通过离子交换层析和亲和层析的方式分离纯化得到蛋白纯品。现有技术的生产方式存在的缺点是酵母菌发酵液含色素使层析柱清洗困难；洗脱时部分色素会随着蛋白一起下柱，使洗脱液带有颜色，降低了蛋白纯度；使用无机盐培养基，酵母菌发酵液含盐浓度高，需要用水大量稀释降低电导后才能挂柱，增加了操作时间和工作量。

基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供一种直接从酵母菌发酵液中分离纯化重组人源溶菌酶的方法。

发明内容

本发明的目的是为克服现有技术存在的缺陷，要解决的技术问题是对分离纯化的方法进行优化，提供一种直接从酵母菌发酵液中分离纯化重组人源溶菌酶的方法。

本发明针对现有技术的分离纯化溶菌酶所使用的层析方法相对繁琐、周期长、所得蛋白纯度不高的缺陷，经几百种层析介质和平衡液的组合尝试，提供了一种处理速度快，成本较低，适合工厂化大规模生产的溶菌酶蛋白层析方法，该方法以阴离子/疏水复合填料(MMC)为介质，配合适当的介质平衡液、洗脱液等，分离纯化获得的产物纯度高。所述的MMC是一种复合型阳离子配基，具有该配基(阴离子/疏水复合填料)的交换层析的介质，可从大批的物料中捕获和中度纯化蛋白上样无需稀释电导，高盐条件下结合蛋白新的选择性、包含离子、疏水和氢键作用Bestarose Diamond MMC与MMC Bestarose 6FF的基质不同，Diamond介质赋予介质更好的工业应用。本发明经过一系列的优化，所述溶菌酶层析方法具有高流速、大体积处理量、操作周期短、提高产量、高刚性基质、耐压性能高的特点。

具体的，

本发明提供了一种重组人源溶菌酶的层析方法，该方法包括以下步骤：

(1)装柱：

层析柱填充介质，并且预平衡；

所述的层析采用的介质是阴离子/疏水复合填料介质；

(2)上样：

将经过离心收集的发酵液上清样品通过预平衡的层析柱；

(3)清洗：

采用10-60mmol/L pH为6.0-7.4的磷酸缓冲液清洗层析柱，2-3个柱体积；