[发明专利]一种高效生产果糖软骨素的重组大肠杆菌及其构建方法

权利要求书

1.一种高效生产果糖软骨素的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌是过表达了磷酸葡萄糖胺变位酶和氨基转移酶，所述磷酸葡萄糖胺变位酶和氨基转移酶是通过核糖体结合位点RBS1与表达载体相连；所述重组大肠杆菌是按照核糖体结合位点RBS1、磷酸葡萄糖胺变位酶glmM基因、寡肽连接子GGGS和氨基转移酶glmS基因的顺序融合后，整合到核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的表达载体上进行表达；所述核糖体结合位点RBS1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述寡肽连接子GGGS的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

2.根据权利要求1所述重组大肠杆菌，其特征在于，所述磷酸葡萄糖胺变位酶和氨基转移酶是通过融合表达方式进行表达。

3.根据权利要求1所述重组大肠杆菌，其特征在于，所述磷酸葡萄糖胺变位酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的氨基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.根据权利要求1所述重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌的宿主为大肠杆菌K4 ATCC 23502。

5.一种权利要求1所述重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，所述构建方法的步骤为：

(1)获得氨基酸序列如SEQ ID NO.1的磷酸葡萄糖胺变位酶glmM和氨基酸序列如SEQID NO.2氨基转移酶glmS基因；

(2)获得核苷酸序列如SEQ ID NO.5的核糖体结合位点RBS1和核苷酸序列如SEQ IDNO.6的寡肽连接子GGGS基因；

(3)获得核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的表达载体pETM6R1；

(4)将步骤(1)和(2)所得的基因，按照核糖体结合位点RBS1、磷酸葡萄糖胺变位酶glmM基因、寡肽连接子GGGS基因和氨基转移酶glmS基因的顺序，连接到步骤(3)的表达载体上，得到重组质粒pETM6R1-RBS1-glmM-GGGS-glmS；

(5)将步骤(4)得到的重组质粒转化到大肠杆菌K4 ATCC 23502中，得到大肠杆菌重组菌。

6.权利要求1所述大肠杆菌在生产果糖软骨素中的应用，其特征在于，所述应用发酵培养基：甘油10g/L，大豆蛋白胨1g/L，KH₂PO₄ 2g/L，K₂HPO₄ 10g/L，MgCl₂ 0.1g/L，(NH₄)₂SO₄1g/L，柠檬酸钠0.5g/L；补料培养基：甘油400g/L，大豆蛋白胨40g/L；37℃下补料分批发酵。

7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述应用是按5-15％的接种量接种至发酵罐中，培养5-10h添加0.05-0.15mmol/L的IPTG进行诱导，诱导温度为35-38℃。

8.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述应用是在发酵过程中，当溶氧陡然上升，开始进行补料，补料策略为pH-stat，当pH超过7.0时，开始补料，当pH低于7.0时，停止补料。