[发明专利]一种高效生产果糖软骨素的重组大肠杆菌及其构建方法

说明书

本发明公开了一种高效生产果糖软骨素的重组大肠杆菌及其构建方法，属于生物工程技术领域。本发明通过分子生物学手段从大肠杆菌K4(ATCC 23502)中克隆获得磷酸葡萄糖胺变位酶基因glmM和氨基转移酶基因glmS，将构建好的表达质粒pETM6R1‑RBS1‑glmM‑GGGS‑glmS导入大肠杆菌K4(ATCC 23502)，通过氨苄青霉素抗性平板筛选获得高效生产果糖软骨素工程菌ZQ33。工程菌株ZQ33在5L发酵罐下采用补料分批发酵策略，发酵36h，果糖软骨素的产量达到了3.99g/L，较野生型菌株提高了108.90％。

技术领域

本发明涉及一种高效生产果糖软骨素的重组大肠杆菌及其构建方法，属于生物工程技术 领域。

背景技术

硫酸软骨素(Chondroitin sulfate，CS)是一种由葡萄糖醛酸(D-GlcUA)与N-乙酰半乳糖 胺(GalNAc)以β-1,3键和β-1,4键交替连接而成的直链酸性粘多糖，广泛存在于人体软骨、 肌腱、椎间盘等结缔组织中，与透明质酸、肝素、硫酸角质素组成了糖胺聚糖。硫酸软骨素 极其类似物具有多种生物活性和药用价值，在临床上用于治疗风湿病和关节炎，可赋予软骨 凝胶样特性和抗变形能力，享有人体“软黄金”之称，同时硫酸软骨素极其类似物作为膳食 补充剂和保湿剂，广泛应用于食品和化妆品领域。

目前，硫酸软骨素极其类似物工业化的主要生产方法为动物组织提取法，即采用碱水解、 蛋白酶酶解等工艺方法从猪、牛、鲨鱼等动物软骨中制得。但是提取法自身存在诸多问题， 如原材料限制、生产工艺复杂、产品质量不稳定、产业水平不高、环境污染严重等，严重制 约了硫酸软骨素极其类似物产业的发展。因此，国内外学者不断探索寻求利用微生物发酵法 高效生产硫酸软骨素极其类似物的方法。

近年来，国内外研究人员从生化工程和代谢工程两个方面对微生物生产硫酸软骨素及其 类似物进行了系统性地研究。其中，1988年发现了E.coli O10:K4:H4的荚膜多糖结构为硫酸 软骨素类似物果糖软骨素，1996年利用K4菌株进行发酵研究，采用Rodriguez的发酵培养基， 果糖软骨素的产量达到了300mg/L，通过表达软骨素合成酶基因kfoC，抗终止子rfaH等策 略提高果糖软骨素的产量。进一步提高果糖软骨素产量成为亟待解决的问题。

发明内容

为解决上述问题，本发明的目的是提供一株高产果糖软骨素的大肠杆菌工程菌，以及应 用该工程菌生产果糖软骨素的方法。本发明通过在大肠杆菌细胞中过量表达合成果糖软骨素 途径中的关键酶(磷酸葡萄糖胺变位酶glmM和氨基转移酶glmS)，进而实现了果糖软骨素 的高效生产，为果糖软骨素的工业化生产奠定了基础。

本发明的第一个目的是提供一种高效生产果糖软骨素的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆 菌是过表达了磷酸葡萄糖胺变位酶和氨基转移酶。

在本发明的一种实施方式中，所述磷酸葡萄糖胺变位酶和氨基转移酶是通过核糖体结合 位点RBS1与表达载体相连；所述核糖体结合位点RBS1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

在本发明的一种实施方式中，所述磷酸葡萄糖胺变位酶和氨基转移酶是通过融合表达方 式进行表达。

在本发明的一种实施方式中，所述磷酸葡萄糖胺变位酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所 示，所述的氨基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌是按照核糖体结合位点RBS1、磷酸葡萄 糖胺变位酶glmM基因、寡肽连接子GGGS和氨基转移酶glmS基因的顺序融合后，整合到 核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的表达载体上进行表达；所述核糖体结合位点RBS1的核苷 酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述寡肽连接子GGGS的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌的宿主为大肠杆菌K4ATCC23502。