[发明专利]一种基于Blocker引物和ARMS引物检测基因突变的方法和试剂盒

权利要求书

1.一种基于Blocker引物和ARMS引物检测基因突变的试剂盒，所述试剂盒包括样本DNA、Blocker引物、ARMS引物、TaqMan探针、聚合酶及缓冲液，用于依次进行富集PCR反应和ARMS荧光定量PCR反应，在Blocker引物的退火温度下，Blocker引物与野生型模板优先结合从而阻断ARMS引物与野生型模板结合，然后在ARMS引物的退火温度下，ARMS引物与突变型模板结合，通过PCR反应富集扩增样本DNA中包含待测基因突变区域的片段，其中，所述Blocker引物为与所检测突变区域的野生型序列完全互补且3’末端进行修饰以阻止其延伸的寡核苷酸，所述ARMS引物的3’末端位于突变区域处，可扩增包含待测基因突变区域的片段并且与突变型序列一致，其中，在所述ARMS引物的3’末端第2个、第3个碱基或第4个碱基处再引入一个错配碱基，其中，所述Blocker引物在合成过程中在其序列中直接引入化学基团提高其Tm值，所述Blocker引物的退火温度比所述ARMS引物的退火温度高20～25℃；ARMS引物及5’端FAM标记的Taqman探针通过荧光定量PCR反应对所述突变基因进行荧光检测；其中所述基因突变为EGFR基因点突变T790M，其中，所述Blocker引物的序列为5’-TGCAGCTCATCACGCAGCTCATG-3’ddC(SEQ ID NO:1)，上游ARMS引物的序列为：5’-CACCGTGCAGCTCATTAT-3’(SEQ ID NO:2)，下游引物的序列为：5’-CACACACCAGTTGAGCAGGTACT-3’(SEQ ID NO:3)；所述Taqman探针的序列为：5’-CCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGT-3’(SEQ ID NO:4)。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其中，在所述Blocker引物的3’末端进行双脱氧碱基修饰；和/或，在所述Blocker引物的5’末端进行去磷酸化修饰。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其中，所述基因突变为EGFR基因19外显子缺失E746_A750缺失突变，其中，所述Blocker引物的序列为：5’-CAAGGAATTAAGAGAAGCAACATC-3’ddC(SEQ ID NO：9)，上游ARMS引物的序列为：5’-AATTCCCGTCGCTATCAAAAC-3’(SEQ ID NO：10)，下游引物的序列为：5’-ACCCCCACACAGCAAAGC-3’(SEQ ID NO：11)，所述Taqman探针的序列为：5’-CCAACAAGGAAATCCTCGATGTGAGTTTCTG-3’(SEQ ID NO：12)。