[发明专利]一种基于Blocker引物和ARMS引物检测基因突变的方法和试剂盒

说明书

本发明公开了一种基于Blocker引物和ARMS引物检测基因突变的方法和试剂盒。本发明中，根据退火温度来设计相应的blocker引物，在blocker的退火温度下，Blocker引物与野生型模板结合，阻断野生型的扩增，同时使用ARMS技术来降低野生型背景的扩增。本发明通过将Blocker富集技术以及ARMS荧光定量PCR技术整合在一个反应体系中，一步即可实现对突变基因的富集和鉴定，减少了操作步骤，提高了检测灵敏度和特异性。

本申请是2012年2月16日提交、申请号201210035665.7和发明名称为“一种基于Blocker引物和ARMS引物检测基因突变的方法和试剂盒”申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及一种检测基因突变的方法和试剂盒。

背景技术

基因突变(gene mutation)是由于DNA分子中发生碱基对的增添、缺失或改变而引起的基因结构的改变。基因突变分为两种，性细胞突变以及体细胞突变。性细胞突变是指发生在性细胞的突变，是可遗传的突变类型。除性细胞外的体细胞发生的突变不会造成后代的遗传改变，却可以引起当代某些细胞的遗传结构发生改变。绝大部分体细胞突变无表型效应。体细胞突变是一种稀有突变，体细胞突变存在于大量的野生型背景DNA序列中，相对于野生型背景序列的含量，体细胞突变含量很少。如肿瘤患者组织和外周血内含有少量的肿瘤细胞DNA，初期出现的细菌和病毒耐药情况等。体细胞突变常与疾病的发病相关，可以作为疾病发病的标志物、预后判断的主要标志以及用药指导的标志物。因此，体细胞突变的检测对于疾病的诊疗和预后评价具有重要的意义。

肺癌是当今世界各国常见的恶性肿瘤，并已成为绝大多数国家癌症死亡的主要原因。其中以非小细胞肺癌(NSCLC)最常见。目前靶向治疗已经成为非小细胞肺癌临床治疗的重要手段。易瑞沙(Iressa/吉非替尼/Gefitinib，阿斯利康)和特罗凯(Tarceva/厄罗替尼/Erlotinib，罗氏制药)作为表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(TKI)，是美国FDA批准用于NSCLC靶向治疗的主要药物。但是，临床试验表明易瑞沙和特罗凯仅对10-30％的NSCLC病人有显著疗效。进一步的研究发现EGFR基因突变L858R和19外显子缺失(E746_A750)与NSCLC靶向治疗的疗效具有相关性，绝大多数携带EGFR基因突变L858R和19外显子缺失(E746_A750)的病人疗效显著。但几乎所有患者迟早均要发生EGFR-TKI性耐药，中位无进展时间只有6-12个月。而EGFR-TKI耐药存在明显的分子靶标，即T790M。EGFR野生型基因序列见Genbank No.NM_005228.3，T790M突变即该序列中第2369个碱基C突变为T。结合EGFR基因突变的检测信息制定出最为适合NSCLC病人个体的肿瘤治疗方案，为临床医生用药提供用药科学依据，降低医生治疗风险以及患者经济负担。

目前体细胞突变的检测方法主要有DNA测序法和突变体富集PCR等技术方法。DNA测序法是进行突变检测的可靠方法，也是使用最多的方法。测序法对取材和技术要求比较高，更重要的是，由于测序方法本身的限制，灵敏度不高，只能对含量大于20％的突变基因进行检测。突变体富集PCR是一种用限制性内切酶选择性消化野生型基因的两步法PCR，与测序法相比，由于突变体富集PCR有两次PCR扩增，检测突变灵敏性更高，特异性强更强，能从104～105个野生型拷贝中检测到一个突变基因。该方法的主要限制因素是，合适限制性内切酶的选择、操作复杂、耗时长、以及两次PCR容易污染。