[发明专利]莲藕中一种新马铃薯Y病毒科病毒的检测试剂盒及其检测方法

说明书

本发明公开了莲藕中一种新马铃薯Y病毒科病毒的检测试剂盒，包括两条特异性引物，所述试剂盒还包括M‑MLV反转录酶、M‑MLV酶反应缓冲液、dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2⁺和PCR反应缓冲液。本发明还提供一种莲藕中新马铃薯Y病毒科病毒的检测方法，其包括以下步骤：(1)提取待测样品总RNA，(2)设计并合成引物，(3)RT‑PCR，(4)电泳检测。本发明提供了一种在莲藕中检测新马铃薯Y病毒科病毒的试剂盒与检测方法，利用RT‑PCR方法检测莲藕中该新型马铃薯Y病毒科病毒，克服了分离莲藕病毒核酸的繁琐步骤，节省时间，大大提高了检测的可操作性、灵敏性和可重复性，为莲藕中该新型马铃薯Y病毒科病毒的防治、脱毒苗的检测提供了有效方法。

技术领域

本发明属于植物病毒检测技术领域，具体涉及莲藕中一种新马铃薯Y病毒科病毒的检测试剂盒与检测方法。

背景技术

莲藕(Nelumbo nucifera)是睡莲科莲属多年生大型水生草本植物，原产中国和印度，有三千多年的栽培历史，生产上可分为藕莲、籽莲和花莲。莲藕富含淀粉、蛋白质、维生素、矿物质等多种营养成分，是我国南方地区的主要水生蔬菜，其栽培面积近33.3万hm2。

本研究室前期研究中发现僵藕中含有马铃薯Y病毒科病毒的典型风轮状内含体结构，这表明莲藕存在某种马铃薯Y病毒侵染。2016年，我们提取莲藕叶片小RNA，进行高通量测序，经BLAST比对发现，部分contig与马铃薯Y病毒科(Potyviridae)马铃薯Y病毒属(Potyvirius)的甘薯潜隐病毒(Sweetpotato latent virus,SPLV)有低于77％相似性，由于其相似性较低，依据Adams等(2005)提出的马铃薯Y病毒科种类划分标准(不同蛋白编码区核苷酸相似性低于74-78％)，应属于一种新的病毒。该病毒由于缺乏完整的基因组序列，不能制备抗血清，无法利用酶联免疫吸附法(ELISA)检测；不清楚寄主范围，尚无法确定鉴别寄主。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供莲藕中一种新马铃薯Y病毒科病毒的检测试剂盒与检测方法。

技术方案：本发明所述的莲藕中一种新马铃薯Y病毒科病毒的检测试剂盒，包括两条特异性引物：

SPLVF2-1：5’-GAATCGTATCAATCCTTGAG-3’；

SPLVR3-1：5’-GCTTCTGCGACATCACTAAAG-3’。

进一步的，所述试剂盒还包括M-MLV反转录酶、M-MLV酶反应缓冲液、dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2⁺和PCR反应缓冲液。

进一步的，所述试剂盒还包括标准阳性模板。

本发明还提供一种莲藕中新马铃薯Y病毒科病毒的检测方法，其包括以下步骤：

(1)提取待测样品总RNA；

(2)设计并合成引物；

(3)RT-PCR

①反转录合成cDNA，以莲藕总RNA为模板，以SPLVR3-1引物，通过反转录酶合成cDNA

②PCR扩增，以cDNA为模板，以SPLVF2-1和SPLVR3-1为引物，进行PCR反应；

(4)电泳检测

吸取2.5μL RT-PCR产物进行0.8-1.5％的琼脂糖凝胶电泳，经核酸染色Goldview，通过凝胶成像仪观察，在感染该新型马铃薯Y病毒科病毒的莲藕样品中有895bp的核酸条带。

进一步的，所述步骤(1)中总RNA提取法采用的是多糖多酚植物组织的裂解法。