[发明专利]一种5-羰基-2-戊烯酰基辅酶A还原酶突变体

权利要求书

1.一种5-羰基-2-戊烯酰基辅酶A还原酶突变体，其特征在于，所述突变体相对于5-羰基-2-戊烯酰基辅酶A还原酶亲本，将第334位的谷氨酸突变为精氨酸；所述5-羰基-2-戊烯酰基辅酶A还原酶亲本的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.编码权利要求1所述突变体的基因。

3.含有编码权利要求1所述突变体核苷酸序列的重组质粒载体。

4.表达权利要求1所述突变体的重组细胞。

5.根据权利要求4所述重组细胞，其特征在于，所述重组细胞还表达了氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的β-酮硫解酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示的3-羟酰基-辅酶A脱氢酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示的3-羟基己二酰脱氢酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示的琥珀酰辅酶A合成酶，以及氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示的琥珀酰辅酶A合成酶。

6.根据权利要求4所述重组细胞，其特征在于，所述重组细胞为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母或毕赤酵母。

7.根据权利要求4所述重组细胞，其特征在于，所述重组细胞的构建方法是：

(1)设计定点突变所用引物，以携带5-羰基-2-戊烯酰基辅酶A还原酶亲本基因的载体为模板进行突变并构建突变体的质粒载体；其中质粒载体是指在质粒pTrc99A上连接氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示的3-羟基己二酰脱氢酶的基因和氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的5-羰基-2-戊烯酰基辅酶A还原酶基因；

(2)将突变质粒转化进宿主细胞；

(3)将连接了氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的β-酮硫解酶基因和氨基酸序列如SEQID NO.6所示的3-羟酰基-辅酶A脱氢酶基因的质粒pRSF转化进宿主细胞；

(4)将连接了氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示的琥珀酰辅酶A合成酶基因和氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示的琥珀酰辅酶A合成酶基因的质粒pCD转化进宿主细胞，最终得到重组细胞。

8.权利要求1所述突变体在生产己二酸中的应用。

9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，所述应用是将含有权利要求1所述突变体的单菌落接入含有Kan，Amp，Str三种抗生素的LB培养基中，35-38℃，200-250r/min摇床培养过夜得到种子液，将种子液以2-5％接种量接入到发酵培养基中，待菌体生长至OD＝0.7左右，加入IPTG诱导，然后转入28-32℃培养。