[发明专利]一种5-羰基-2-戊烯酰基辅酶A还原酶突变体

说明书

本发明公开了一种5‑羰基‑2‑戊烯酰基辅酶A还原酶突变体，属于生物工程领域。本发明对产己二酸代谢途径3‑氧代己二酰辅酶A途径中的限速基因Tfu_1647进行定点突变，得到一株己二酸产量提高的突变体。采用本发明的突变菌株发酵24h，己二酸产量由对照菌株的0.24g/L提高到1.01g/L，提高了近5倍。采用本发明的突变体，大大提高了己二酸产量，降低生产成本，促进己二酸在工业上的推广应用。

技术领域

本发明涉及一种5-羰基-2-戊烯酰基辅酶A还原酶突变体，属于生物工程领域。

背景技术

己二酸(adipic acid)又称肥酸，是一种重要的平台化合物，当前己二酸最重要的应用领域是合成尼龙类纤维(比如尼龙6,6)。预计到2018年，己二酸全球的市场价值将达到63亿美元。

工业上己二酸的生产路线主要通过硝酸对环己醇—环己酮的混合物(醇酮油，也称KA油)进行氧化制取。但是该方法具有工艺流程长、副产物多、产品收率低、工业“三废”排放严重等问题，特别是温室气体的排放量十分大。因此，人们迫切需要寻找一种能替代传统化学合成己二酸的方法。随着生物技术的发展，全生物合成法生产有机酸具有生产成本低，生产工艺简单，污染小，产品纯度高等优势，所以该方法越来越受人们青睐。近年来，许多国内外的研究机构投入了大量的资源对上述方法进行了深入的研究。总部位于美国Genomatica公司和Verdezyne公司是该研究领域的领跑者。

Verdezyne公司通过研究发现，有些酵母在降解甘油三酯的程中能够积累己二酸。比如该公司利用椰子油(coconut oil)作为底物，利用酵母，将皂化后的脂肪酸经过一系列β氧化和ω氧化，成功积累了己二酸。由于该方法仅能以椰子油做底物，所并不适合在我国推广。

Genomatica公司通过生物信息学和系统的方法，寻找到了多种可能利用糖质原料全生物合成己二酸的途径，并对其中两个代谢途径的可行性进了探讨，其中一个途径是3-氧代己二酸途径(3-oxoadipate pathway)，另一个是3-氧代己二酰辅酶A途径(3-oxoadipyl-CoApathway)。经过计算，该公司认为以上两种途径在大肠杆菌中表达后都能达到92％的理论产率(以葡萄糖为底物)。

上海交通大学的钟建江教授研究团队发现了与3-氧代己二酰辅酶A途径类似的途径(如图1)，然后将不同来源的5种酶的基因，连接到质粒后导入大肠杆菌进行表达，从而获得己二酸的积累。本人所在团队对一株褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)进行代谢改造后，发现该工程菌株B6能够生产己二酸。本团队发现该菌生产己二酸的途径为3-氧代己二酰辅酶A途径(如图1)，包括：Tfu_0875(β-酮硫解酶，β-ketothiolase)，Tfu_2399(3-羟酰基-辅酶A脱氢酶，3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase)Tfu_0067(3-羟基己二酰脱氢酶，3-hydroxyadipyl-CoA dehydrogenase)，Tfu_1647(5-羧基-2-戊烯酰辅酶A还原酶，5-carboxy-2-pentenoyl-CoAreductase)以及Tfu_2577和Tfu_2576(succinyl-CoAsynthase，琥珀酰辅酶A合成酶)。将该途径的六种基因导入到大肠杆菌中，同样也获得了己二酸的积累。但是这两个途径都不能高效积累己二酸。

发明内容

为解决上述问题，本发明以表达5-羰基-2-戊烯酰基辅酶A还原酶的基因Tfu_1647为研究对象，通过Discovery Studio(DS)对Tfu-1647理性预测并进行定点突变，以提高目的产物己二酸的产量。

本发明的第一个目的是提供一种5-羰基-2-戊烯酰基辅酶A还原酶突变体，所述突变体相对于5-羰基-2-戊烯酰基辅酶A还原酶亲本，将第334位的谷氨酸突变为精氨酸。

在本发明的一种实施方式中，所述5-羰基-2-戊烯酰基辅酶A还原酶亲本的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。