[发明专利]一种桑蚕丝素蛋白单克隆抗体的制备方法

权利要求书

1.一种桑蚕丝素蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

A）称取15g桑蚕丝并将其以1:45-55的浴比添加至去离子水中，加入2.25-3.75g碳酸钠，于90-98℃水浴下恒温脱胶55-65min，结束后调节pH至中性，反复操作多次，将脱胶后的桑蚕丝加入去离子水中浸泡，然后烘干；

B）将450-550mL异辛烷与900-1100mL正辛醇混合，搅拌混匀得到混合油性溶剂，称取0.3-0.5mol的双（2－乙基己基）琥珀酸酯磺酸钠，0.3-0.5mol的聚乙烯基吡啶季铵盐溶于450-550mL前述混合油性溶剂中；

C）称取1.5g碳酸钠和2.9g碳酸氢钠，加入到700-800mL去离子水中，搅拌溶解后定容至1000mL，调节pH至9.5-9.7，得到碳酸盐缓冲溶液；取步骤A）中烘干后的桑蚕丝5g溶于45-55mL碳酸盐缓冲溶液中，搅拌至完全溶解后加入至45-55mL步骤B）所得的混合油性溶剂中，混合均匀，再搅拌处理，然后离心处理，取上层溶液备用；

D）称取29.2g氯化钠，加入到450-550mL去离子水中，搅拌溶解后定容至1000mL，调节pH至9.4-9.5，取步骤C）所得上层溶液，按体积比0.9-1.1:1与氯化钠溶液混合，混匀后搅拌处理，然后离心处理，取下层水相；

E）取步骤D）所得下层水相，倒入透析袋中进行透析，透析后对透析袋中剩余溶液进行冷冻干燥，对干燥后获得的样品进行研磨，得到桑蚕丝素蛋白完全抗原，备用；

F）用生理盐水溶解步骤E）所得桑蚕丝素蛋白完全抗原，控制浓度为1-2 mg/mL，然后与QuickAntibody-Rabbit8W按体积比0.9-1.1:1混合，制得抗原佐剂混合溶液；选取2只大白兔进行初次免疫，用抗原佐剂混合溶液对每只兔的后大腿和皮下进行多点注射，在完成初次免疫后的第3周使用同样的抗原佐剂混合溶液对兔子进行皮下多点注射，进行加强免疫；第5周选取免疫后效价相对较高的大白兔进入单克隆抗体制备；

G）用0.4-0.6 mg步骤E）所得桑蚕丝素蛋白完全抗原对选取的大兔进行静脉注射，7天后在无菌条件下取出脾脏，在无菌培养皿中将脾脏清理干净，用1640培养液冲洗，将洗净后的脾脏放入无菌皿中，加入1640培养液10mL，将脾脏碾碎过筛网，然后用1640培养液悬浮，在10000-14000 rpm下离心4-6 min，移除上清液，再洗涤一次，得到细胞悬液，并将其浓度稀释为含有1×10⁸个脾淋巴细胞的悬液，备用，在细胞融合试验前5天，另行取骨髓瘤细胞进行传代培养；

H）取步骤G）培养得到的脾淋巴细胞和骨髓瘤细胞按1.8-2.2:1的数量比混匀，加培养液后在10000-14000 rpm下离心4-6 min，弃上清液，在35-39℃水浴中恒温加热，并缓缓加入聚乙二醇-1500，再加入1640培养液稀释，在10000-14000 rpm下离心，弃上清后将细胞用20%HAT选择培养液悬浮；

I）步骤H）中细胞融合10天后，用间接ELISA法选出分泌抗体呈阳性，抗体分泌能力强，细胞生长状态良好的杂交瘤细胞，用HAT培养基扩大培养后，用有限稀释法在96孔板内进行克隆化，选择单个细胞集落孔的培养上清作抗体检测，阳性者用同样方法再次克隆，直至克隆后有杂交瘤细胞生长的抗体分泌阳性率为100%；利用筛选出的细胞进行大转生产，收集兔单克隆抗体进入纯化阶段；

J）pH 7.4的PBS溶液的制备；

K）对步骤I）中所得兔单克隆抗体进行纯化：用10mL，0.5mol/L的NaCl溶液和10mL，0.05mol/L，pH7.4的PBS溶液对蛋白柱进行清洗，清洗流速为58-62 mL/h；用30mL，0.05mol/L，pH7.4的PBS溶液将收集到的兔单克隆抗体稀释，稀释后上样，重复上样一次；用20mL，0.05mol/L，pH7.4的PBS溶液清洗柱子，清洗的流速为115-125 mL/h，使其在280nm处的紫外吸收接近基线；用0.5mol/L的NaCl溶液和0.05mol/L，pH7.4的PBS溶液进行洗脱；洗脱完成后用0.05mol/L，pH7.4的PBS溶液洗涤多肽柱，获得纯化后的桑蚕丝素蛋白单克隆抗体，在1-5℃下储存备用。

2.如权利要求1所述的一种桑蚕丝素蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤A)中，将脱胶后的桑蚕丝加入至180-220mL去离子水中浸泡1.5-2.5h，然后在55-65℃下烘干。