[发明专利]一种桑蚕丝素蛋白单克隆抗体的制备方法

说明书

本发明涉及考古检测领域，公开了一种桑蚕丝素蛋白单克隆抗体的制备方法。该方法采用异辛烷，正辛醇，双（2－乙基己基）琥珀酸酯磺酸钠，聚乙烯基吡啶季铵盐混合体系提取桑蚕丝素蛋白，然后将桑蚕丝素蛋白作为完全抗原注射到家兔体内，选出免疫效价高的家兔，将其脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，得到的杂交瘤细胞经培养后用间接ELISA法选出分泌抗体呈阳性，抗体分泌能力强，细胞生长状态良好的菌株，用有限稀释法克隆至有杂交瘤细胞生长的抗体分泌阳性率为100%为止，用筛选出的细胞进行大转生产，然后利用层析柱对所得单抗进行纯化。本发明制备的抗体具有很强的特异性，且其在应用过程中操作简单快捷，检测准确性高。

技术领域

本发明涉及考古检测领域，尤其涉及一种桑蚕丝素蛋白单克隆抗体的制备方法。

背景技术

蚕丝是一种天然高分子蛋白质纤维，主要分为柞蚕丝和桑蚕丝两大类。鉴于桑蚕丝的起源问题一直笼罩在迷雾中，迫切需要一种更科学的方法来鉴定出土的丝织品。蚕丝的常规检测方法主要有傅里叶红外光谱、拉曼光谱、X-射线衍射等，但蚕丝长期处于墓葬或遗址环境中会受到多种因素影响，从而出现蛋白质降解及大分子链断裂等问题，采用传统的一些方法很难检测到丝素蛋白的存在。因此如何采用自然科学的先进手段，建立丝织品微痕检测技术体系，从印痕，残留物，土壤中提取古代丝绸的信息，对研究丝绸的起源至关重要。当前蛋白质检测的先进技术是基于抗体-抗原的WesternBlotting或ELISA法，桑蚕丝素蛋白抗体的制备是该研究的一个关键环节。目前已出现了桑蚕丝素蛋白的多克隆抗体，抗体的特异性取决于抗原分子的决定簇，抗原分子具有很多抗原决定簇，因此免疫动物产生的抗体为多种抗体的混合物，要把这些不同的抗体分开十分困难，同时多克隆抗体存在纯度低、理化性状不均一、与抗原结合特异性不强等问题。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种桑蚕丝素蛋白单克隆抗体的制备方法。本发明方法制备的抗体特异性强，且其在应用过程中操作简单快捷，检测准确性高。

本发明的具体技术方案为：一种桑蚕丝素蛋白单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

A）称取15g桑蚕丝并将其以1:45-55的浴比添加至去离子水中，加入2.25-3.75g碳酸钠，于90-98℃水浴下恒温脱胶55-65min，结束后调节pH至中性，反复操作多次，将脱胶后的桑蚕丝加入去离子水中浸泡，然后烘干。

B）将450-550mL异辛烷与900-1100mL正辛醇混合，搅拌混匀得到混合油性溶剂，称取0.3-0.5mol的双（2－乙基己基）琥珀酸酯磺酸钠，0.3-0.5mol的聚乙烯基吡啶季铵盐溶于450-550mL前述混合油性溶剂中。

与现有方法相比，本发明采用双（2－乙基己基）琥珀酸酯磺酸钠和聚乙烯基吡啶季铵盐复配，这两种成分能相互作用，提升蛋白质的提取率，同时对蛋白质结构没有损害。

C）称取1.5g碳酸钠和2.9g碳酸氢钠，加入到700-800mL去离子水中，搅拌溶解后定容至1000mL，调节pH至9.5-9.7，得到碳酸盐缓冲溶液；取步骤A）中烘干后的桑蚕丝5g溶于45-55mL碳酸盐缓冲溶液中，搅拌至完全溶解后加入至45-55mL步骤B）所得的混合油性溶剂中，混合均匀，再搅拌处理，然后离心处理，取上层溶液备用。

D）称取29.2g氯化钠，加入到450-550mL去离子水中，搅拌溶解后定容至1000mL，调节pH至9.4-9.5，取步骤C）所得上层溶液，按体积比0.9-1.1:1与氯化钠溶液混合，混匀后搅拌处理，然后离心处理，取下层水相。

本发明的步骤C）和步骤D)前后两次进行混匀离心，使蛋白质来回溶解在油相和水相中，对提高蛋白质的提取率有显著作用。

E）取步骤D）所得下层水相，倒入透析袋中进行透析，透析后对透析袋中剩余溶液进行冷冻干燥，对干燥后获得的样品进行研磨，得到桑蚕丝素蛋白完全抗原，备用。