[发明专利]一步法实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测人基质金属蛋白酶1的试剂盒

说明书

本发明为一种实时荧光定量RT‑PCR检测人基质金属蛋白酶1的试剂盒，该试剂盒以mRNA为模板，使反转录和实时荧光定量PCR在同一反应体系中进行，反应过程中无需打开管盖，避免了交叉污染，并可以精确定量检测标本中人基质金属蛋白酶1 (MMP1) 的mRNA表达量。该试剂盒可以用于临床及科研中检测患者结直肠癌手术切除标本中MMP1的表达，用以结直肠癌患者辅助诊断、指导治疗是否存在肝转移的指标。

技术领域

本发明属生物技术领域，为一种通过以mRNA为模板，使反转录和实时荧光定量PCR在同一反应体系中进行的检测技术，可以精确定量检测标本中人基质金属蛋白酶1 (MMP1)的mRNA表达量的试剂盒。

背景技术

上世纪中期，随着人们生存居住环境、饮食习惯以及生活水平的不断改变、不断提高，与此同时各类肿瘤的发病率/死亡率也呈逐年上升趋势。结直肠癌的发病率和死亡率仅次于肺癌和乳腺癌，已成为第三恶性肿瘤。结直肠癌具有高度恶性与侵袭性的生物学特性，常发生浸润、转移，此生物学特性是导致患者预后较差及死亡率较高的一个重要因素。结直肠癌的发生、发展是与多基因相关、多因素相互影响、多步骤、错综复杂循序渐进的过程；然而其诊治关键要点与大多数肿瘤一样，在于早期发现、早期诊断、早期治疗。临床研究表明，早期结直肠癌的手术治愈率可以达到 80%-90%，然而结直肠癌患者常常因早期缺乏特异性的临床症状与体征，不易引起患者足够的重视，难以在患病早期及时的发现并行手术治疗。多数结直肠癌患者在发现时已是中期，甚至是晚期，即使行手术治疗，也难以达到患者理想的效果，术后复发转移率较高，生存期也较短，预后不佳。近几年，以消化道内镜结合病理学检查为主的诊断方法在临床上广泛应用，但是针对我国目前医疗现状来说，暂不适合大规模消化内窥镜筛查，进而导致早期行手术治疗率较低。临床发现中晚期结直肠癌患者即使进行手术治疗，也有 30%-40%的患者术后出现复发或转移播散，复发和转移目前导致结直肠癌患者死亡最主要原因之一。近年来，结直肠癌治疗及手术方案有了明显的改善与进步，同时各种后期治疗手段如：放、化疗在不断更新与完善，生物治疗、基因治疗等新方法不断涌现。血循环中存活的肿瘤细胞是远处转移和复发的基础，尽管各种结直肠癌的各种检测方法不断的增多，然而这一类细胞数量极微，不易被临床常规手段检测出来。近年来，通过逆转录聚合酶链反应 (RT-PCR) 技术检测外周血中微量循环肿瘤细胞(Circulatingtumor cell，CTC) 已成为可能并被尝试。

基质金属蛋白酶是一种细胞外基质肽链内切酶,所有基质金属蛋白酶含有共同的一个保守序列,这也是与金属离子结合的部位,其催化活性依赖于酶活性中心与金属锌离子的结合。基质金属蛋白酶最初都是细胞分泌的以无活性的酶的前体形式存在,只有通过被激活才能发挥作用。研究发现：基质金属蛋白酶1 (MMP1)在结直肠癌患者体内的表达量增加，而检测原发结直肠癌患者同时伴有肝转移者时，发现MMP1的表达量增高更加明显。一步法荧光定量PCR技术使反转录和PCR扩增在同一反应体系中进行，反应过程中无需打开管盖，避免交叉污染，节省实验时间。具有方便、便捷、重复性好等特点。

发明内容

本发明试剂盒包含：逆转录聚合酶链反应液 (RT-PCR反应液)、莫洛尼氏鼠白血病病毒 (M-MuLV) 逆转录酶、RNA酶抑制剂 (Rnasin)、耐热性DNA聚合酶 (Taq DNA聚合酶)、标准品、阴阳性对照品。

其中逆转录聚合酶链反应液含有焦炭酸二乙酯处理的水、逆转录聚合酶链缓冲液、寡聚(dT)_15-18(Oligo(dT)_15-18)、dNTPs、MgCl₂、检测用上下游引物、荧光探针。

检测用引物分检测用上游引物和检测用下游引物：

上游引物序列为：5’—GGTGCAGTGGCTCACACTTG—3’，

下游引物序列为：5’—GGCTGGAGTGTAGTGGTACAATCTT—3’，