[发明专利]促进罗汉果UGT73AF1基因表达的方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因技术，尤其涉及一种促进罗汉果UGT73AF1基因表达的方法。

背景技术

罗汉果甜苷V属于葫芦烷型四环三萜类物质，罗汉果甜苷V生物合成的前体物质是异戊烯二磷酸(IPP)和3,3-二甲基烯内基焦磷酸(DMAPP)，二者是通过甲羟戊酸(MVA)和甲基赤藓糖醇磷酸化(MEP)两条途径形成， MVA途径发生在胞质中，MEP途径发生在质体中。来源于上述两途径的IPP 或DMAPP经牻牛儿基焦磷酸合酶(GPS)催化形成牻牛儿基焦磷酸(GPP)， IPP与GPP在法呢基焦磷酸合酶(FPS)的催化作用下进而形成法呢基焦磷酸 (FPP)，然后经角鲨烯合酶(SS)、角鲨烯环氧化酶(SE)的催化形成2,3- 氧化角鲨烯，葫芦二烯醇合酶(CS)进一步催化形成葫芦二烯醇，最后在 CYP450酶和葡萄糖基转移酶(UGT)的作用下，形成罗汉果甜苷V。

异戊二烯类物质的产生受到限速酶活性的严格调控，一直被认为在其生物合成途径中起着重要的调控作用。作为异戊二烯途径中的限速酶，UGT基因的表达对罗汉果甜苷V的生物合成起着决定性作用。过表达UGT基因，可以促进罗汉果甜苷V的积累；相反，如果抑制UGT基因的表达，罗汉果甜苷V的产量将显著降低。现有技术中未见有促进罗汉果UGT73AF1基因表达的报道。

发明内容

针对上述技术问题，本发明设计开发了一种促进罗汉果UGT73AF1基因表达的方法。

本发明提供的技术方案为：

一种促进罗汉果UGT73AF1基因表达的方法，包括：

步骤一、罗汉果组培苗接种在含有茉莉酸甲酯的固体培养基中培养，其中，茉莉酸甲酯在固体培养基中的浓度为50-400μmol/L；培养期间，每隔3 天将罗汉果组培苗从所述固体培养基中取出，用清水将根部冲洗干净，静置 10分钟，之后再将罗汉果组培苗重新接种回所述固体培养基中；

步骤二、栽培所述步骤一培养得到的罗汉果植株，在栽培期间，将浓度为50-400μmol/L的茉莉酸甲酯喷洒于授粉后20-30d的罗汉果表面，至表面滴水为止，早、中、晚各喷洒一次，连续喷施5d。

优选的是，所述的促进罗汉果UGT73AF1基因表达的方法中，所述步骤一中，所述培养条件为：相对湿度60-66％、光照强度1400lux，光照时间8h/d，温度21-25℃条件下培养30d。

优选的是，所述的促进罗汉果UGT73AF1基因表达的方法中，所述的固体培养基配比为MS+6-BA 1.5mg/L，IBA 0.3mg/L，琼脂3.5g/L，蔗糖30g/l，活性炭1.0g/L。

优选的是，所述的促进罗汉果UGT73AF1基因表达的方法中，所述步骤一中，所述含有茉莉酸甲酯的固体培养基通过以下方式制备得到：用体积百分比浓度为2％的乙醇水溶液溶解茉莉酸甲酯，配制成10000μmol/L的茉莉酸甲酯母液，并用0.22μm的微孔滤膜灭菌，将灭菌后的茉莉酸甲酯母液添加到固体培养基中，至茉莉酸甲酯的最终浓度为50-400μmol/L，将固体培养基灭菌并冷却至24-26℃。

优选的是，所述的促进罗汉果UGT73AF1基因表达的方法，还包括：

步骤三、利用qRT-PCR检测所述步骤二栽培得到的罗汉果果实中的 UGT73AF1基因表达。

优选的是，所述的促进罗汉果UGT73AF1基因表达的方法中，所述步骤三中，采用改良Trizol法提取罗汉果果实总RNA。

本发明通过在罗汉果组培苗和栽培罗汉果施加茉莉酸甲酯，短期内快速诱导罗汉果甜苷V生物合成途径中关键酶基因UGT73AF1的高表达，从而促进罗汉果甜苷V含量的显著提高。本发明操作简便，成本低，对环境友好，适于规模化生产，具有较强的实用性和推广价值。

具体实施方式

下面对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

实施例一

一种促进罗汉果UGT73AF1基因表达的方法，包括：