[发明专利]一种石斛N‑连接糖组的MALDI‑TOF分析方法

权利要求书

1.一种石斛N-连接糖组的MALDI-TOF分析方法，包括以下步骤：

(1)铁皮石斛糖蛋白的提取；

(2)用PNGase F从糖蛋白上切下糖链；

(3)糖链的衍生；

(4)固相萃取；

(5)MALDI-TOF对糖链进行质谱解析。

2.如权利要求1所述的石斛N-连接糖组MALDI-TOF分析方法，其特征在于所述步骤(1)包括取石斛原料粉碎，加入10倍干重的双蒸水，匀浆，浸提12h，离心取上清；沉淀加入10倍干重的双蒸水重复浸提，合并两次浸提的上清即为石斛糖蛋白。

3.如权利要求1所述的石斛N-连接糖组MALDI-TOF分析方法，其特征在于所述步骤(2)包括以10KDa滤膜超滤，加入0.5％SDS的缓冲液和50mM DTT的变性缓冲液，56℃变性15min；将变性后糖蛋白加入50mM磷酸盐缓冲液配制的PNGase F中，37℃孵育12h，得含游离糖的PNGase F酶解液。

4.如权利要求1所述的石斛N-连接糖组MALDI-TOF分析方法，其特征在于所述步骤(3)包括向步骤(2)获得的含游离糖的PNGase F酶解液中加入17氟癸胺对糖链进行修饰衍生，在糖链分子中引入氟。

5.如权利要求1所述的石斛N-连接糖组MALDI-TOF分析方法，其特征在于所述步骤(4)包括将步骤(3)获得的产物过氟固相萃取柱，富集含有氟标签的糖链，氮气吹干除去溶剂，再以20μL 50％的甲醇/水溶液复溶。

6.如权利要求1所述的石斛N-连接糖组MALDI-TOF分析方法，其特征在于所述步骤(5)包括取步骤(4)获得的产物4μL点样于靶板上，真空抽干，再加含10mg/mL DHB和1mM NaAc的溶液2μL，真空抽干，使用MALDI-TOF质谱仪用阳离子模式进行质谱检测。

7.如权利要求6所述的石斛N-连接糖组MALDI-TOF分析方法，其特征在于所述步骤(5)中质谱参数如下：离子源1:7.5kV；离子源2：6.75kV；反射电压1:29.5kV，反射电压2:13.95kV；激发光源为337nm，质荷比范围为500-2000。

8.如权利要求1-7所述石斛N-连接糖组MALDI-TOF分析方法，其中所述的石斛为铁皮石斛、霍山石斛。

9.如权利要求1-7所述石斛N-连接糖组的MALDI-TOF分析方法在获得石斛蛋白糖组图谱中的应用。

10.如权利要求1-7所述石斛N-连接糖组的MALDI-TOF分析方法在鉴定石斛真伪中的用途，包括将待测样本的糖组图谱与石斛标准品糖组图谱进行对比。