[发明专利]一种石斛N‑连接糖组的MALDI‑TOF分析方法

说明书

技术领域

本发明属于糖组学分析领域，涉及一种石斛N-连接糖组的分析方法，具体涉及MALDI-TOF分析石斛N-连接糖组的方法。

背景技术

石斛为我国传统中药材，其药用价值为人们所共识。经研究发现，多糖是石斛属植物的主要活性成分。然而，目前针对石斛活性成分的研究方法仍主要是“提取→分离→纯化→结构鉴定”的传统方法，糖类活性成分的研究不系统，随机性大、效率低下，至今尚未明确石斛活性糖成分的具体结构。

根据基因组和蛋白质组的定义，糖组应该被定义为单一生物体中的整套聚糖系统。糖组学是继基因组学和蛋白组学后的新兴研究领域，它的研究结果直接关系到是否能够阐明基因功能及细胞功能。不同生物体中的糖组，无法统一，更无法由基因组推测。对糖组的研究最合适的做法是将糖组分解为不同的小组，平林淳和笠井献一的研究组迄今所着眼的是糖蛋白组，而且以线虫的基因组为基础。

目前糖组研究方法较少，糖蛋白为主的糖组学技术问题和发展趋势主要集中于以下四大技术难点：a.糖蛋白分离的问题；b.糖蛋白的基因识别效率较低；c.糖链的结构分析和共价键的确定仍然不是一件容易的工作；d.目前这些糖组研究方法几乎是静态的，而生物体的糖基化过程是动态的。

糖是组成生命体的四大类重要分子之一，糖蛋白质是由糖链与肽链中的特定氨基酸残基以糖苷键共价连接而成的蛋白质。糖蛋白质普遍存在于生物体内，在很多生命过程中起着重要作用，如蛋白质的折叠、细胞之间的相互识别等。同时，糖基化修饰对植物品质的鉴定、活性成分的发现和解析都具有重要意义。以基质辅助激光解吸电离质谱和电喷雾质谱为代表的生物质谱技术，因具有快速、灵敏、可提供结构信息等优点，有望成为糖蛋白质组和糖组分析的重要工具。

高灵敏地鉴定生物体内的N-糖链是研究其结构和组成的首要前提。然而，N-糖链研究面临着以下困难：首先，糖基化修饰的蛋白质种类众多、但含量较低；其次，N-糖链在质谱中的离子化效率较低，难以被质谱鉴定；再次，N-糖链围观结构不均一导致糖链在质谱中信号分散和减弱，难以被质谱鉴定；最后，N-糖链的富集困难，选择性差。

发明内容

针对上述现有技术中石斛N-连接糖组学研究的不足，本发明建立了石斛N-连接糖组的MALDI-TOF分析方法，通过该方法解析出超过32种的石斛N-连接糖类型，为石斛活性成分的发现和石斛品质的鉴定提供了有效的检测手段。

一方面，本发明提供一种石斛N-连接糖组的MALDI-TOF分析方法，包括以下步骤：

(1)铁皮石斛糖蛋白的提取；

(2)用PNGase F从糖蛋白上切下糖链；

(3)糖链的衍生；

(4)固相萃取；

(5)MALDI-TOF对糖链进行质谱解析。

本发明所述的石斛N-连接糖组MALDI-TOF分析方法，其特征在于所述步骤(1)包括取石斛原料粉碎，加入10倍干重的双蒸水，匀浆，70℃浸提12h，离心取上清；沉淀加入10倍干重的双蒸水重复浸提，合并两次浸提的上清即为石斛糖蛋白；将石斛糖蛋白采用sevage法去除游离蛋白，加入无水乙醇至终浓度70％醇析沉淀糖蛋白。

本发明所述的石斛N-连接糖组MALDI-TOF分析方法，其特征在于所述步骤(2)包括将石斛糖蛋白上清液10kDa滤膜超滤，取截留液加入0.5％SDS的缓冲液和50mM DTT的变性缓冲液，56℃变性15min；将变性后糖蛋白加入50mM磷酸盐缓冲液配制的PNGase F中，37℃孵育12h，10KDa滤膜超滤，取透过液，得含游离糖的PNGase F酶解液。

本发明所述的石斛N-连接糖组MALDI-TOF分析方法，其特征在于所述步骤(3)包括向步骤(2)获得的含游离糖的PNGase F酶解液中加入17氟癸胺对糖链进行修饰衍生，在糖链分子中引入氟。

所述17氟癸胺的结构式如下：

本发明所述的石斛N-连接糖组MALDI-TOF分析方法，其特征在于所述步骤(4)包括将步骤(3)获得的产物过氟固相萃取柱，富集含有氟标签的糖链，氮气吹干除去溶剂，再以20μL 50％的甲醇/水溶液复溶。

本发明所述的石斛N-连接糖组MALDI-TOF分析方法，其特征在于所述步骤(5)包括取步骤(4)获得的产物4μL点样于靶板上，真空抽干，再加含10mg/mL DHB和1mM NaAc的溶液2μL，真空抽干，使用MALDI-TOF质谱仪用阳离子模式进行质谱检测。