[发明专利]一株大肠杆菌抗肿瘤靶向工程菌株及其构建方法与应用

说明书

一株大肠杆菌抗肿瘤靶向工程菌株及其构建方法与应用，所述大肠杆菌抗肿瘤靶向工程菌株，即Escherichia coliNissle 1917(Tum‑5),保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2017345。该抗肿瘤靶向工程菌含有抗肿瘤分泌表达载体pET28a‑Pvhb‑SUMO‑Tum 5，能可溶性表达和分泌性表达肿瘤抑素Tumstatin的抗肿瘤血管生成活性区域Tum‑5。本发明还包括所述大肠杆菌抗肿瘤靶向工程菌株的构建方法与在制备抗肿瘤药物中的应用。该株抗肿瘤靶向工程菌对荷B16黑色素瘤C57BL/6小鼠的肿瘤抑制率高达52.95%。

技术领域

本发明涉及一株大肠杆菌抗肿瘤靶向工程菌株及其构建方法与在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

细菌用于癌症治疗具有悠久的历史。虽然细菌治疗肿瘤的临床机制尚不清楚，但是细菌在治疗某些疾病，特别是治疗癌症方面起着非常重要的作用。传统化疗和放疗治疗通常不能完全消除肿瘤，这归因于实体瘤中肿瘤厌氧微环境的肿瘤细胞。大多数哺乳动物正常组织中的氧浓度为而在肿瘤组织中，坏死区边界处的基质附近正常浓度逐渐降低至缺氧状态(O₂0.02％)。一系列研究表明，癌症治疗基因的肿瘤靶向表达可能是癌症治疗中有效和安全的方法。许多细菌，如沙门氏菌、大肠杆菌、梭菌、双歧杆菌和李斯特菌能够优先在肿瘤中积累。

肠道益生菌Escherichia coli Nissle 1917(EcN)已经在多个国家被用来治疗腹泻和结肠炎溃疡(Gut.2004；53(11):1617-23)。Stritzker J等研究表明，EcN可以在肿瘤低氧区域特异性定殖(Int J Med Microbiol.2007；297(3):151-62)。基于实体瘤组织的缺氧微环境和 EcN定殖的特点，应用EcN作为传输载体传送抗肿瘤活性蛋白至肿瘤区，在未来癌症治疗中将是一个有前景的肿瘤治疗途径。

细菌治疗肿瘤存在一定的缺陷：使用活菌直接治疗患者时，由于某些细菌的致病性和靶向性差可能会导致机体产生严重的感染或治疗效果差，经济性也欠佳。因此，构建安全性好和靶向性高的抗肿瘤靶向工程菌株已成为细菌治疗肿瘤亟需解决的问题。

大肠杆菌EcN虽然对实体瘤具有高度靶向性，能在肿瘤低氧区域特异性定殖，可作为传输载体传送抗肿瘤活性蛋白至肿瘤区域；但是真核抗肿瘤蛋白在原核细菌中表达时存在困难：蛋白可溶性表达情况欠佳、容易形成包涵体蛋白、难以获得具有正常空间结构的活性蛋白。所以，真核抗肿瘤蛋白如何实现在原核细胞中的有效表达也是细菌治疗肿瘤应用中需要解决的难点。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于，克服现有技术存在的上述缺陷，在大肠杆菌中高效表达真核抗肿瘤蛋白Tum-5，提供一株肿瘤靶向性较高、经济性较好和安全性高的大肠杆菌抗肿瘤靶向工程菌株及其构建方法与在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明解决其技术问题采用的技术方案如下。

本发明之大肠杆菌抗肿瘤靶向工程菌株，即Escherichia coli Nissle 1917(Tum-5),缩写为EcN(Tum-5),于2017年6月16日在中国典型培养物保藏中心保藏，菌种保藏号为CCTCC NO：M 2017345。

本发明之大肠杆菌抗肿瘤靶向工程菌株的构建方法如下：

(一)利用PCR拼接获得Tum-5基因

根据GenBank中登录的登记号为AF258351.1的Homo sapiens 的Tumstatin蛋白的基因序列，查找出编码Tum-5蛋白所对应的核苷酸序列，设计2条以上的寡核苷酸链，便于进行PCR拼接以获得 Tum-5基因；

(二)Tum-5诱导表达载体的构建及鉴定；

(三)Tum-5蛋白的诱导表达、纯化及鉴定；