[发明专利]一种重组质粒、构建方法和用于分枝杆菌精准基因组改造

权利要求书

1.一种pMK5228质粒，包括 pMK101质粒的元件，还包括：

一个来自于pGOAL19质粒的筛选标记和一个来自于链霉菌pIJ773质粒的阿泊拉霉素抗性筛选标记apra；

该pGOAL19质粒的筛选标记包括了三个基因：一个潮霉素抗性基因，一个半乳糖苷酶筛选标记lacZ和一个基于蔗糖的反筛选标记sacB；

所述的pMK5228质粒，其基因序列为SEQ ID NO:3；

所述pMK101质粒含有sceM基因，

命名为sceM的基因表达酶能在分枝杆菌中有特定位点切割活性，其基因序列为SEQ IDNO:1；

pMK101质粒还包括：

一个pBR322的复制起始区；

一个氨苄青霉素的抗性基因amp，用于大肠杆菌构建质粒时筛选重组质粒；

一个控制所述sceM基因表达的抑制诱导型启动子tetO-tetR，该启动子在ATC诱导下可开启sceM基因的转录和后续的表达；

所述质粒pMK101的基因序列为SEQ ID NO:2；

质粒pMK101的构建方法为：

步骤1，使用BglⅡ和NheⅠ双酶切pEN4.1A-T10M质粒，得到Pimyc-tetRDNA片段；

使用BamHⅠ和XbaⅠ双酶切pBlueScript SK(-)质粒，同时加入所述Pimyc-tetRDNA片段连接得到pKS-Pimyc-tetR；

步骤2，使用NdeⅠ和KpnⅠ双酶切pLU101质粒,将sceM克隆至pLU101质粒的NdeⅠ和KpnⅠ位点，得到pLU102；随后使用PstⅠ和EcoRⅠ双酶切pLU102，得到923bp的包含PtipA+sceM的DNA片段；

使用PstⅠ和EcoRⅠ双酶切步骤1获得的所述pKS-Pimyc-tetR质粒，加入所述PtipA+sceM的DNA片段后两者连接得到pKS-Pimyc-tetR-PtipA-sceM；

步骤3，

3.1步骤，使用引物teto_F：tttaCTGCAGATTGGATCGTCGGCACCGTCA和teto_R：tttacatatgGCGGATCGTGCTCATTTCGG，以质粒pEN12A-P1为模板，得到Pmyc-tetO启动子，使用PstⅠ和NdeⅠ双酶切，得到Pmyc-tetO启动子DNA片段，备用；

3.2步骤，使用PstⅠ和NdeⅠ双酶切步骤2中重组质粒pKS-Pimyc-tetR-PtipA-sceM用于去除PtipA启动子，并加入步骤3.1备用的所述Pmyc-tetO启动子DNA片段，最终得到pKS-Pimyc-tetR-Pmyc-sceM，实现构建质粒pMK101；

所述pMK5228质粒的构建方法为

使用引物SC_U_F:tttagaattcAACCCGGTGTGCGATCTGGT，

SC_U_R: ATCGCAGATGTCGCCCGTG；

SC_D_R1: ACCCTGTTATCCCTAGGGTTCTGCGAGGACGACA，

SC_D_R : GGGTTCTGCG AGGACGACA,

SC_D_R3：atttTCTAGAGCGTTAATTAAACTAGTAGATCTAAGCTTGATTACCCTGTTATCCCTAGGGTTCTGCG AGGACGACA

PCR整合获得MSMEG_5228上下游分别为820bp和946bp的敲除重组交换臂，HindⅢ和EcoRⅠ酶切后与HindⅢ和EcoRⅠ双酶切pMK101连接获得pMK1011质粒；

XbaⅠ酶切获得pIJ773质粒的apramycin抗性基因，克隆入pMK1011质粒，获得质粒pMK1012；

PacⅠ酶切pGOAL19质粒，获得hyg-lacZ-sacB片段；同样以PacⅠ酶切质粒pMK1012，将hyg-lacZ-sacB片段克隆入pMK1011，获得最终精准敲除MSMEG_5228的靶向质粒pMK5228。

2.一种pMK90-43质粒，包括权利要求1中所述的pMK101质粒的元件，其特征在于，还包括：

用于敲除基因簇MSMEG_5990-MSMEG_6043两侧的重组交换臂；

来自于pGOAL19质粒的筛选标记；该筛选标记包括了三个基因：潮霉素抗性基因、半乳糖苷酶筛选标记lacZ、基于蔗糖的反筛选标记sacB；

来自于链霉菌pIJ773质粒的阿泊拉霉素抗性筛选标记；

所述的pMK90-43质粒的基因序列为SEQ ID NO:4；

所述的pMK90-43质粒的构建方法，

使用引物：

5990_SF:tttagaattcTGGTTGGCAG TCCGTGCACA，

5990_R: GGCTCGATGA CCGGGGTG;

90-43F1: CAC CCCGGTCATC GAGCC ATCGACA TCCACTCGGCCGA，

6043_R: GGTTGCTGAG GCGGTGAATGA，

6043_SR: atttTCTAGAGCGTTAATTAAACTAGTAGATCTAAGCTTGATTACCCTGTTATCCCTAGGTTGCTGAG GCGGTGAATG A

PCR整合获得MSMEG_5990-MSMEG_6043上下游分别为865bp和938bp的敲除重组交换臂，采用HindⅢ和EcoRⅠ酶切后与HindⅢ和EcoRⅠ双酶切权利要求1中所述的pMK101连接获得pMK1013质粒；

XbaⅠ酶切获得pIJ773质粒的apramycin抗性基因，克隆入pMK1013质粒，获得质粒pMK1014；

PacⅠ酶切pGOAL19质粒，获得hyg-lacZ-sacB片段；同样以PacⅠ酶切质粒pMK1014，将hyg-lacZ-sacB片段克隆入pMK1014，获得最终精准敲除基因簇MSMEG_5990-MSMEG_6043的靶向质粒pMK90-43。