[发明专利]一种重组质粒、构建方法和用于分枝杆菌精准基因组改造

说明书

本发明涉及基因组改造技术,为一种重组质粒、构建方法和用于分枝杆菌精准基因组改造。本发明技术方案涉及能在分枝杆菌中进行精准基因组编辑的质粒构建及其在分枝杆菌中进行连续精准基因敲除的应用。使用本发明方法进行分枝杆菌基因组编辑的目的DNA片段长度理论上可从bp‑Mb级别且在改造后不在基因组上留下任何疤痕。该方法的建立可为高致病分枝杆菌的致病机理研究和重要甾体激素药物前体生产的重要分枝杆菌工业菌株的基因组改造提供极其重要的基因组编辑手段。

技术领域

本发明涉及基因组改造技术。

背景技术

20世纪80年代以来，植物甾醇微生物转化生产前体如4AD、9-OH-AD和ADD等已逐渐成为大多数类固醇药物(雄激素，类固醇，雌激素和皮质类固醇)的合成原料。分枝杆菌具有复杂的胆固醇代谢途径，可以代谢植物来源的具有复杂成份的甾醇侧链，经过几十年的诱变育种和基因工程改造，已逐渐成为高效经济地生产此类中间体的主要工业菌株。

结核病是困扰全球多年的严重公共健康问题，该病由结核分枝杆菌引起，每年造成约200万人死亡。结核分枝杆菌生长缓慢，可以以胆固醇为唯一碳源生长，对其研究特别是开展基因组操作存在较大的难度。耻垢分枝杆菌mc²155是分枝杆菌特别是结核分枝杆菌使用胆固醇作为唯一碳源和能量源进行生长研究的模式生物，生长快速且无致病性，经过改造后有望成为类固醇合成前体的细胞工厂。Beatriz等(2016)研究表明经过简单的敲除MSMEG_6039(kshB1)和MSMEG_5941(kstD1)，M.smegmatis mc²155即可高效地转化植物甾醇生产ADD和4AD等类固醇激素药物合成原料。

虽然分枝杆菌的基础研究在疾病治疗和工业生产上均具有重要价值，但由于各种原因(如可能对分枝杆菌的重要性认识较晚)，基于分枝杆菌的操作系统相比放线菌目内的其他属如链霉菌属分子操作手段仍显匮乏。2000年，Tanya等在结核分枝杆菌(M.tubeiculosis)中开发了基于p2NIL和pGOAL质粒的基因打靶系统。该系统由pGOAL质粒提供筛选标记，p2NIL质粒提供多克隆位点以方便克隆重组交换臂及筛选标记。该系统至今仍然是分枝杆菌操作的主要手段。该技术在实际操作过程中仍然相对耗时。如果需要进行基因的插入及精准突变等基因组特定位点的编辑，仍然非常困难且效率不高。

同源重组(Homologous recombination)广泛存在于自然界的生命体中。同源重组的分子过程在生物体内普遍存在，可由DNA双链断裂(DSB)诱导自身蛋白参与的修复。I-sceI是一个染色体的稀有内切酶，亦被称为归巢核酸内切酶，首先发现于酵母线粒体的内含子中。I-sce I识别18bp的非对称序列(attaccctgttatcccta)，在染色体上加入这个序列可以被该酶识别并切割，诱导宿主体内的重组蛋白表达参与DSB的修复，最终导致分子间的重组修复。该系统本质是基于传统的重组臂交换或非同源末端环化等分子机理(NHEJ)以达到敲除基因组上特定DNA片段的技术。