[发明专利]尿中1-溴丙烷代谢物N-乙酰基-S-(正丙基)-L-半胱氨酸的测定方法

说明书

本发明公开了尿中1‑溴丙烷代谢物N‑乙酰基‑S‑(正丙基)‑L‑半胱氨酸的测定方法，取尿样，加入脲酶，25℃水浴震荡10~15min，离心，取上清液；移取上清，加入乙醇‑吡啶混合液，混合；加入氯甲酸乙酯，涡旋混合30~90s，加入三氯甲烷充分震荡后分层；三氯甲烷层作为样品，进样，程序升温，根据峰面积依据工作曲线得出尿中N‑乙酰基‑S‑(正丙基)‑L‑半胱氨酸的浓度。尿样预处理简单，操作更为简洁，方法的准确度和精密度高,重复性好，尿样最低检出浓度为2μg/L，灵敏度高。

技术领域

本发明属于尿中代谢物的测定方法，具体涉及一种尿中1-溴丙烷代谢物N-乙酰基-S-(正丙基)-L-半胱氨酸的测定方法。

背景技术

1-溴丙烷（1-Bromopropane，1-BP，CAS：106-94-5)），又名正溴丙烷，常用于生产喷雾黏合剂、精密仪器的清洗剂和脱脂剂，也作为制药产业、杀虫剂和季胺类化合物合成的中间体。因其在大气中半衰期短，不破坏大气臭氧层等特点，1-BP被美国环保署(EPA)氟利昂替代品审查计划确定为氟利昂类替代品之一并被迅速推广,使用量逐年上升。研究报道已发现1-BP对雄性大鼠生殖系统具有毒性，对人和大鼠的神经系统都具有毒性。大鼠在高浓度长时间暴露下会导致体重降低、运动神经传导速度降低等病变。美国曾报道工人长期暴露在含有1-BP的材料导致了可能的神经系统疾病。体外实验表明1-BP有潜在致突变作用，工人职业性接触1-溴丙烷后体内白细胞出现DNA损伤也见诸报道。我国是1-BP 主要生产国，职业暴露人群逐年增加，除制定工作场所空气中1-BP的测定方法外，有必要开发一种简单而有效的检测方法来测量其生物标志物，以便更全面的对职业人群的暴露水平进行评估。

职业接触1-BP可经呼吸道和皮肤吸收进入体内，可通过多种途径排出体外，包括以原形方式排出、脱溴、经P450氧化以及与谷胱甘肽结合等，其在尿中的主要代谢产物包括N-乙酰基-S-(正丙基)-L -半胱氨酸（AcPrCys）及其相应的氧化产物。目前，还没有发现其他溴化物会代谢产生AcPrCys，因此，AcPrCys可以作为1-BP职业暴露的生物标志物。多种分析方法已被用于的测定尿中AcPrCys：加纳等使用NMR测得在大鼠尿中AcPrCys达到1 - BP的总剂量的约37％（Garner CE,Sumner SC,Davis JG,el a1.Metabolism anddisposition of1-bromopropane in rats and mice following inhalation orintravenous administration.Toxicol Appl Pharmacol,2006,215:23-36.）；周长美等（1-溴丙烷在尿中的主要代谢物N-乙酰基-S-(正丙基)-L-半胱氨酸的测定）采用C18反相色谱柱分离，以乙腈和0.2%乙酸水溶液为流动相梯度淋洗，用HPLC-MS-MS法进行测定，其他研究者也开发了利用GC-MS和HPLC-MS-MS的测定方法，都需要对样品进行前处理，并且主要检测N-乙酰基-S-(正丙基)-L-半胱氨酸，而1-BP在体内的代谢途径显示有一部分转化为7N-乙酰-S-2-丙基-L-半胱氨酸、N-乙酰-S-2氧丙基-L-半胱氨酸、N-乙酰-S-2-羟乙基-L-半胱氨酸，因此要建立更准确的尿中1-溴丙烷的代谢产物的检测方法极为重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种尿中1-溴丙烷代谢物N-乙酰基-S-(正丙基)-L-半胱氨酸的测定方法，采用气相色谱-质谱法，尿样预处理简单，操作更为简洁，方法的准确度和精密度高,重复性好。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

尿中1-溴丙烷代谢物N-乙酰基-S-(正丙基)-L-半胱氨酸的测定方法，包括如下步骤：

1）样品准备：取尿样，加入脲酶，25℃水浴震荡10~15min，离心，取上清液；

2）样品衍生化：移取上清，加入乙醇-吡啶混合液，混合；加入氯甲酸乙酯，涡旋混合30~90s，加入三氯甲烷充分震荡后分层；