[发明专利]一种通过CRISPR/Cas9系统快速获得大片段缺失的细胞系基因敲除方法

权利要求书

1.一种通过CRISPR/Cas9系统快速获得大片段缺失的细胞系基因敲除方法，其特征在于：包括如下步骤：

1）选定待敲除的目标基因，使用在线sgRNA设计软件，获得两个sgRNA序列，sgRNA序列之间的间隔为50-100 bp；

2）将步骤1）获得的sgRNA序列添加酶切位点并合成单链引物，将配对的引物退火得到对应的带有粘性末端的双链DNA片段，将双链DNA片段分别连接入带有不同荧光报告基因的CRISPR/Cas9系统表达载体中，一个双链DNA片段对应连接一个带有荧光报告基因的CRISPR/Cas9系统表达载体，将构建好的表达载体等量混合后转入细胞；所述不同荧光报告基因为DsRed2和ECFP；

3）细胞经培养后使用流式细胞仪进行阳性筛选，分离包含全部荧光报告基因信号的单克隆细胞；

4）将获得的单克隆细胞扩大培养，10-15天后取细胞通过直接裂解法获取基因组DNA；

5）设计包含靶位点PCR检测引物，以步骤4）获得的基因组DNA为模板进行PCR扩增，将扩增产物进行凝胶电泳检测，挑选大片段缺失的纯合子细胞系。

2.根据权利要求1所述的通过CRISPR/Cas9系统快速获得大片段缺失的细胞系基因敲除方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）将pX458中的EGFP荧光报告基因替换为DsRed2和ECFP，分别命名为：pX458- DsRed2和pX458-ECFP；选定待敲除的目标基因，使用在线sgRNA设计软件，获得两个sgRNA序列，两个sgRNA序列之间的间隔为50-100 bp；

2）将步骤1）获得的两个sgRNA序列添加酶切位点并合成4条单链引物，将配对的引物退火得到两条带有粘性末端的双链DNA片段，再将双链DNA片段分别连接入载体pX458-DsRed2和pX458-ECFP，得到pX458- DsRed2-sgRNA1和pX458-ECFP-sgRNA2表达载体；

3）将pX458- DsRed2-sgRNA1和pX458-ECFP-sgRNA2表达载体通过脂质体转染或电转的方式转入细胞，培养后使用流式细胞仪对DsRed2和ECFP荧光报告基因进行双阳性单细胞分选；

4）将获得的单克隆细胞扩大培养，10-15天后取细胞通过直接裂解法获取基因组DNA；

5）设计包含两个靶位点PCR检测引物，以步骤4）获得的基因组DNA为模板进行PCR扩增，将扩增产物进行凝胶电泳检测，挑选大片段缺失的纯合子细胞系。

3.根据权利要求2所述的通过CRISPR/Cas9系统快速获得大片段缺失的细胞系基因敲除方法，其特征在于：步骤1）中当所述的目标基因为Gfi1b时，两个sgRNA序列分别为：5‘-AGTGACAAGCGCTAGTCCTTTGG-3’，5‘-TTACCACCAGCCCCGGGCACAGG3’。

4.根据权利要求2所述的通过CRISPR/Cas9系统快速获得大片段缺失的细胞系基因敲除方法，其特征在于：步骤1）中当所述的目标基因为Pparg时，两个sgRNA序列分别为：5‘-GTATACCTAACAAGATACTATGG-3’，5‘-GTGAAGCTGTGCGTCATTTCAGG-3’。

5.根据权利要求2所述的通过CRISPR/Cas9系统快速获得大片段缺失的细胞系基因敲除方法，其特征在于：步骤1）中当所述的目标基因为DSG4时，两个sgRNA序列分别为：5‘-CTTAGCCGTAAGGATTGCCGAGG-3’，5‘-GTGGTTGTCATCGCAATCACAGG-3’。

6.根据权利要求2所述的通过CRISPR/Cas9系统快速获得大片段缺失的细胞系基因敲除方法，其特征在于：步骤2）中在设计引物时，如果上游引物的5‘起始碱基不是G，则额外添加一个碱基G。

7.根据权利要求2所述的通过CRISPR/Cas9系统快速获得大片段缺失的细胞系基因敲除方法，其特征在于：步骤3）中培养40-80h后，使用流式细胞仪进行单细胞分选。