[发明专利]一种通过CRISPR/Cas9系统快速获得大片段缺失的细胞系基因敲除方法

说明书

本发明涉及一种通过CRISPR/Cas9系统快速获得大片段缺失的细胞系基因敲除方法，属于基因工程和遗传修饰领域。本发明改造pX458载体，使其带有DsRed2和ECFP，然后针对目标基因设计多个特异性的sgRNA位点，将其连接至改造载体中，转染细胞系后利用流式细胞仪对细胞群进行分选，可以非常快速获得基因组被编辑的单细胞，然后用PCR扩增单细胞DNA序列，通过凝胶电泳即可以从中挑选出具有大片段缺失的单细胞。本发明通过将CRISPR/Cas9系统、流式细胞仪单细胞分选和表达载体上的荧光蛋白筛选三者结合起来，可以在短时间内获得具有大片段缺失的阳性单克隆，极大地提高细胞系基因敲除工作效率。

技术领域

本发明涉及一种通过CRISPR/Cas9系统快速获得大片段缺失的细胞系基因敲除方法，属于基因工程和遗传修饰领域。

背景技术

CRISPR-Cas9系统是近年来被研究和利用最为广泛的的一种基因组编辑技术，与传统的基因组编辑方法：锌指核酸酶(ZFNs)和转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)相比，CRISPR-Cas9系统具有以下优势：结构简单，对其改造和操作非常容易；对基因组的编辑效率很高，容易获得基因敲除个体；在实际使用过程中没有物种限制，所以其在动物、植物和细胞系等基因敲除模型制作中得到了非常广泛应用。

传统的细胞系基因敲除需要在转染以后经过多轮抗性筛选和稀释才能得到阳性单克隆细胞，非常费时费力，而且假阳性率很高。CRISPR/Cas9系统在切割基因组DNA以后，大多数情况下都会形成少数几个碱基的缺失或是插入，通过传统的凝胶电泳不能检测出这种微小的改变；而其它一些方法，例如：直接测序法、PCR酶切检测法、T7E1酶切检测法、高分辨率溶解曲线检测法，可以检测出打靶位点是否产生了碱基改变，但是不能得到碱基缺失或是插入的具体数目；PAGE电泳检测法、荧光PCR法可以比较准确得到碱基改变的详细信息，但是PAGE电泳检测法操作复杂，荧光PCR法需要使用昂贵的仪器设备，都不适合进行高通量筛选和大范围推广。

发明内容

本发明的目的是提供一种通过CRISPR/Cas9系统快速获得大片段缺失的细胞系基因敲除方法，该检测方法简单易行，通过对目标基因同时进行多处打靶，即可以获得大片段DNA缺失。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种通过CRISPR/Cas9系统快速获得大片段缺失的细胞系基因敲除方法，包括如下步骤：

1)选定待敲除的目标基因，使用在线sgRNA设计软件，获得至少两个sgRNA序列，sgRNA序列之间的间隔为50-100bp；

2)将步骤1)获得的sgRNA序列添加酶切位点并合成单链引物，将配对的引物退火得到对应的带有粘性末端的双链DNA片段，将双链DNA片段分别连接入带有不同荧光报告基因的CRISPR/Cas9系统表达载体中，一个双链DNA片段对应连接一个带有荧光报告基因的CRISPR/Cas9系统表达载体，将构建好的表达载体等量混合后转入细胞；

3)细胞经培养后使用流式细胞仪进行阳性筛选，分离包含全部荧光报告基因信号的单克隆细胞；

4)将获得的单克隆细胞扩大培养，10-15天后取细胞通过直接裂解法获取基因组DNA；

5)设计包含靶位点PCR检测引物，以步骤4)获得的基因组DNA为模板进行PCR扩增，将扩增产物进行凝胶电泳检测，挑选大片段缺失的纯合子细胞系。

上述的通过CRISPR/Cas9系统快速获得大片段缺失的细胞系基因敲除方法，包括如下步骤：

1)将pX458中的EGFP荧光报告基因替换为DsRed2和ECFP，分别命名为：pX458-DsRed2和pX458-ECFP；选定待敲除的目标基因，使用在线sgRNA设计软件，获得两个sgRNA序列，两个sgRNA序列之间的间隔为50-100bp；