[发明专利]促进罗汉果CYP26基因表达的方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物生物技术领域。更具体地说，本发明涉及一种促进罗汉果CYP26基因表达的方法。

背景技术

罗汉果是我国特有珍贵药用和甜料植物，为葫芦科(Cucurbitaceae)罗汉果属(Siraitia)多年生藤本植物，具有止咳祛痰、凉血舒胃、润肠通便等作用。其主要成分甜苷V是世界上最强的非糖甜味物质之一，为蔗糖甜度的300-400倍，是一种低热量、纯天然的甜味剂及理想的保健品，此外还有抗氧化、免疫调节、抗癌、降血糖等作用。

甜苷V目前还不能化学合成，主要依靠提取获得。罗汉果对生境要求苛刻，只适宜在广西生长，且栽培中不能连作，果实中甜苷V含量低，无法满足市场需求，因此亟待探索提高甜苷V含量的新途径、新方法。

罗汉果甜苷V属于葫芦烷型四环三萜类物质，本课题组前期根据罗汉果转录组数据，已推导出甜苷V可能的生物合成途径。罗汉果甜苷V生物合成的前体物质是异戊烯二磷酸(IPP)和3,3-二甲基烯内基焦磷酸(DMAPP)，二者是通过甲羟戊酸(MVA)和甲基赤藓糖醇磷酸化(MEP)两条途径形成，MVA途径发生在胞质中，MEP途径发生在质体中。来源于上述两途径的IPP或DMAPP经牻牛儿基焦磷酸合酶(GPS)催化形成牻牛儿基焦磷酸(GPP)，IPP与GPP在法呢基焦磷酸合酶(FPS)的催化作用下进而形成法呢基焦磷酸(FPP)，然后经角鲨烯合酶(SS)、角鲨烯环氧化酶(SE)的催化形成2,3-氧化角鲨烯，葫芦二烯醇合酶(CS)进一步催化形成葫芦二烯醇，最后在CYP450酶和葡萄糖基转移酶的作用下，形成罗汉果甜苷V。

异戊二烯类物质的产生受到限速酶活性的严格调控，一直被认为在其生物合成途径中起着重要的调控作用。作为异戊二烯途径中的限速酶，CYP450酶基因的表达对罗汉果甜苷V的生物合成起着决定性作用。过表达CYP450酶基因，可以促进罗汉果甜苷V的积累；相反，如果抑制CYP450酶基因的表达，罗汉果甜苷V的产量将显著降低。然而，CYP450酶基因是个超基因家族，本课题组前期研究发现，CYP26与罗汉果甜苷V的合成途径有一定关联。现有技术中未见有促进罗汉果CYP26基因表达来提高罗汉果中甜苷V含量的报道。

发明内容

作为各种广泛且细致的研究和实验的结果，本发明的发明人已经发现，在罗汉果种植过程中，喷洒含有茉莉酸甲酯的溶液可以刺激并诱导罗汉果中CYP26基因的表达，从而促进CYP450酶基因表达，促进罗汉果甜苷V的生物合成和累积。基于这种发现，完成了本发明。

本发明的一个目的是解决至少上述问题和缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种通过茉莉酸甲酯对罗汉果组培、育苗、果实发育进行干涉处理来促进CYP26基因表达基因表达的方法，可以有效促进罗汉果中甜苷V含量积累。

本发明还有一个目的是通过组织培养和人工授粉来促进优良植株的选育和规模化种植，进一步促进罗汉果甜苷V的产量。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种促进罗汉果CYP26基因表达的方法，包括：将罗汉果组培苗的根系中根长小于最长根长度1/2的短根剪除，再将2～3条粗壮根用无菌刀分别划2～3个伤口，再用介质包覆所述组培苗的根系，连续变温处理5次，然后进行磁化处理，最后将所述组培苗上的介质去除其中其中处理过程中添加茉莉酸甲酯浓度为1.0～2.0mg/L；

植株开花后对花粉进行特殊处理得到花粉液，用电动喷雾器将所述花粉液喷洒在开花的雌花植株进行人工授粉，其中花粉液中茉莉酸甲酯的浓度为0.5～1.0mg/L；

植株开花授粉后10天，连续喷洒7天的诱导液，其中所述诱导液中茉莉酸甲酯为0.5～1.0mg/L。

优选的是，其中，所述介质为处理过的玉米须，所述玉米须需要经洗净干燥，于25℃水温的预浸泡溶液浸泡处理2h，所述预浸泡溶液中含有1mg/L的纳米银、0.5mg/L BA、1g/L柠檬酸钠、3μg/L的生根粉、0.15g/L葡甘露聚糖，以去离子水为溶剂。

优选的是，其中，所述变温处理均为将所述组培苗先置于2℃下贮存1min，再置于25℃下贮存5min，其中处理条件为湿度为60～70％。

优选的是，其中，所述磁化处理为将所述组培苗置于磁化机内，设置磁场强度为200～250高斯，磁化时间为1h，磁化温度25～27℃。

优选的是，其中，所述组培苗移栽包括：

将组培苗用0.1％的高锰酸钾或10～50mg/L的新洁尔灭溶液浸泡灭菌；