[发明专利]一种锚定巢式多重PCR联合高通量测序检测基因融合的多重PCR引物和方法

说明书

本发明提供了一种锚定巢式多重PCR联合高通量测序检测基因融合的多重PCR引物，包括多重PCR特异性引物组1和多重PCR特异性引物组2，所述多重PCR特异性引物组1为SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:32所示的核苷酸序列组成的引物组，所述多重PCR特异性引物组2为SEQ ID NO:33～SEQ ID NO:64所示的核苷酸序列组成的引物组。本发明还提供了一种锚定巢式多重PCR联合高通量测序检测基因融合的多重PCR引物和方法，本发明检测方法通用性更高，本发明检测方法能够在仅部分知晓或未知晓融合基因结构的情况下，准确灵敏地检测融合基因。

技术领域

本发明涉及检测领域，更具体地涉及一种锚定巢式多重PCR联合高通量测序检测基因融合的多重PCR引物和方法

背景技术

研究表明，在哺乳动物(如人)中，基因融合是导致某些疾病(如癌症)的原因之一。

以混合谱系白血病基因(mixed lineage-leukemia gene，简称为“MLL”)为例，MLL融合蛋白可以引起下游基因的表观遗传学修饰异常，导致下游癌基因激活，从而诱发白血病。

MLL异位产生的融合蛋白发挥着致癌基因的作用，除了最常见的MLL-MLLT3(acutemyeloid leukemia(AML)急性髓性白血病)、MLL-MLLT2(AF4)外，还有MLL与以下伙伴基因形成融合基因：MLLT1(ENL)、MLLT10(AF10)、MLLT4(AF6)、ELL等。

在诸多的MLL融合基因中，对于acute myeloid leukemia(AML)急性髓性白血病，大约有18％AML是MLLT3基因(也称为AF9)与MLL发生重排(MLL-r)导致的；目前，与MLL发生融合的50多种基因中，MLLT3基因是第二多的，MLLT3-MLL的融合基因研究表明其与肿瘤的发生发展有着密切的联系。

目前，对融合基因的研究大部分的采用RT-PCR的方法，小部分研究采用免疫组化、FISH的方法进行检测。

RT-PCR的方法是针对已知的MLL融合基因的类型以及融合方式来设计引物，将RNA反转录获得cDNA之后，通过PCR扩增目的片断的方式来进行检测。该方法的局限性：1)必须知晓与MLL基因发生融合的基因；2)必须知晓两基因发生融合的方式；3)不能或难以同时检测不同基因与MLL发生的融合。因此利用该方法须针对与MLL发生融合的不同基因，必须根据不同融合方式设计不同的引物来进行检测，且不能检测出未知的MLL融合基因以及未知的融合方式，这将直接导致MLL融合基因检测困难及检出率的降低。

非放射性原位杂交技术FISH法的原理是设计与被检测的MLL-MLLT3同源互补的核酸探针，二者经变性-退火-复性，即可形MLL-MLLT3融合基因的DNA与核酸探针的杂交体。用报告分子(如生物素、地高辛)标记核酸探针的某一种核苷酸，可利用该报告分子与荧光素标记的特异性配基(如特异性与生物素结合的亲和素)之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性以及相对定位分析。然而，该方法局限性：1)必须知晓与MLL基因发生融合的基因；2)与MLL发生融合的基因所在染色体的位置必须与MLL相距较近的距离；3)不能同时检测不同基因与MLL发生的融合。因此该方法须针对与MLL基因发生融合的不同基因设计不同的探针，且不能检测出未知的MLL融合基因，这将影响到MLL基因的检测率。

鉴于各种融合基因(如MLL融合基因)的表达产物对癌症等疾病的发生发展起着重要作用，因此，本领域迫切需要开发更为通用的融合基因检测方法。

此外，本发明还迫切需要开发，在部分知晓或未知晓融合基因结构的情况下，能够准确灵敏地检测方法来检测融合基因(如MLL融合基因)的方法。

发明内容