[发明专利]一种新型表达Cry3A杀虫蛋白的植物内生工程菌及其构建方法与应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种新型表达Cry3A 杀虫蛋白的植物内生工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

榆树是多种天然林的重要组成部分。在我国，许多品种被用作道路观赏、花园装饰、土壤保护而广泛种植。然而，近几十年，许多成年榆树死于虫害。对此，许多森林保护者和研究人员在这一森林病害的防治上做了大量的工作，并开发了许多用于昆虫防治的化学和生物制剂。然而，许多化学杀虫剂，如有机磷农药、有机氯农药，已被证明对环境和人类健康造成伤害。

苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis(BT)分泌的杀虫晶体蛋白 (ICPS)因其对害虫具有高度专一毒杀作用，且对环境和人畜安全的特性，成为世界上应用最广泛的一类微生物杀虫剂。根据杀虫晶体蛋白氨基酸序列的同源性，可将他们划分为17群94亚类，目前已报道的编码Cry蛋白的基因达300多个，其中Cry1类的表达产物对鳞翅目昆虫有特异毒性，而Cry3类的表达产物对鞘翅目昆虫有特异毒性。国内外一般都优先选用Cry3Aa基因作为抗虫基因转入微生物构建具有抗鞘翅目昆虫杀虫活性的BT工程菌。

公开号为CN 105647952A的文献公开了一种新型原核表达载体的构建及生防菌开发应用，方法通过ORF对ORF的方式替换掉原有载体的GFP蛋白，利用原载体翻译GFP蛋白的启动子来表达目的基因，通过重组构建验证，得到一种兼具杀虫、抑菌功能的生防菌。

发明内容

本发明的目的是通过优化，创新改进现有常规表达载体难表达或不表达外源基因的缺陷，提供一种新型表达Cry3A杀虫蛋白的植物内生工程菌及其构建方法与应用，实现外源基因Cry3A杀虫蛋白在野生 B.pyrrocinia JK-SH007内生菌中的高效表达。

本发明解决所述技术问题的方案是：一种新型表达Cry3A杀虫蛋白的植物内生工程菌，该工程菌的DNA序列如序列表SEQ ID NO： 1所示。

一种新型表达Cry3A杀虫蛋白的植物内生工程菌的构建方法，包括如下步骤，

(1)Cry3Aa的人工合成：Cry3Aa的密码子序列来自于苏云金芽孢杆菌，Cry3Aa根据大肠杆菌密码子偏好进行优化，通过引物设计，合成DNA；

(2)重组质粒构建：将T7RNA聚合酶基因利用同源重组的方式连接到PHKT2载体上，得到重组质粒pHKT2-T7RNA pol；在重组质粒pHKT2-T7RNA pol上构建吡咯伯克霍尔德氏菌B. pyrrocinia-Cry3Aa表达载体质粒，得到重组质粒pHKT2-Cry3Aa；

(3)Cry3Aa基因在吡咯伯克霍尔德氏菌B.pyrrocinia JK-SH007 中的表达：将重组质粒pHKT2-Cry3Aa导入B.pyrrocinia JK-SH007 感受态细胞,涂布浓度为50ug/mL含甲氧苄啶抗生素的LB抗性平板上，30℃过夜培养；Cry3Aa的蛋白表达通过将重组菌接于LB培养基，采用30℃，220r/min摇培，待OD600＝0.8时,加终浓度为 0.1mmol/L IPTG,并迅速升温到42℃，继续培养4h，然后取工程菌液离心，再将沉淀重悬于PBS缓冲液,利用超声波破碎后离心收集细胞裂解液。

一种新型表达Cry3A杀虫蛋白的植物内生工程菌在防治榆蓝叶甲中的应用。

本发明选用了针对鞘翅目害虫的Cry3A杀虫蛋白，运用T7超表达系统，通过对Cry3A密码子的优化、表达载体的筛选、插入位置的分析、诱导条件浓度等的组合优化，实现了重组工程菌的构建，使具有抑菌功效的植物内生菌吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007高效表达了 Cry3A蛋白。通过生测实验，工程菌B.pyrrocinia JK-SH007(pHKT2-Cry3Aa)被证明对榆树甲虫幼虫具有较好的控制效果。本发明建立了以吡咯伯克霍尔德氏菌为宿主的苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白的表达系统，将有助于开发环保的生物农药，具有相当的生防潜力。

附图说明

序列表SEQ ID NO:1是本发明生防菌的DNA序列；

图1为pHKT2-T7RNApol质粒图谱；

图2为T7RNA聚合酶和phkt2线性化载体扩增电泳分析结果，其中，M为λ-EcoT14I分子标记，条带1为T7RNA聚合酶，条带2 为pHKT2线性化载体；

图3为pHKT2-Cry3Aa质粒图谱；