[发明专利]基于SCX/SAX混合填料的集成化蛋白质组学样品前处理平台及其应用

说明书

本发明公开了基于SCX/SAX混合填料的集成化蛋白质组学样品前处理平台及其应用，所述蛋白质组学样品前处理平台包括移液枪枪头(1)、强阳离子交换树脂和强阴离子交换树脂混合填料(2)和固相萃取膜(3)；所述固相萃取膜(3)填充于移液枪枪头(1)的下端，强阳离子交换树脂和强阴离子交换树脂混合填料(2)填充于移液枪枪头(1)下端并位于固相萃取膜(3)之上。本发明的蛋白质组学样品前处理平台在混合离子交换填料上完成样品预富集、还原、烷基化、酶解步骤，该反应器的特点在于所使用的混合离子交换填料可在任意pH值下实现蛋白质富集，且酶解pH置换过程中，蛋白质损失少，胰蛋白酶可以在两种填料之间来回移动，酶解效率更高。

技术领域

本发明涉及蛋白质组学技术领域，尤其涉及基于SCX/SAX混合填料的集成化蛋白质组学样品前处理平台及其应用。

背景技术

近年来，基于生物质谱的蛋白质组学技术已被广泛应用于蛋白质的大规模定性和定量表征，在基础生物学和生物医学等相关领域得到广泛地应用。样品预富集是整个蛋白质组学分析流程中至关重要的一步，决定着整个样品分析的灵敏度和精确度。目前，越来越多的科研工作者致力于寻找更高效的蛋白质预富集方法，以降低蛋白质在富集过程中的损失，以提高整个蛋白质组学分析流程的性能。

基于强阳离子交换填料(SCX)和强阴离子交换填料(SAX)的蛋白质预富集方法已经在蛋白质组学领域得到了成功地应用。其中，基于SCX填料的蛋白质预富集方法的原理是在酸性条件下大部分蛋白质的等电点因大于溶液pH值而带正电荷，从而被填料表面的SCX基团所富集；而基于SAX填料的蛋白质预富集方法的原理是在碱性条件下大部分蛋白质的等电点小于溶液pH值而带负电荷，从而被填料表面的SAX基团所富集。例如，田等人在RareCell Proteomic Reactor Applied to Stable Isotope Labeling by Amino Acids inCell Culture(SILAC)-based Quantitative Proteomics Study of Human EmbryonicStem Cell Differentiation中公开了基于SCX毛细管整体柱的在线细胞样品处理方法，通过整体柱上的SCX基团有效地富集蛋白，结合集成化的还原，烷化和酶解等蛋白质组学前处理步骤，大大减少了样品损失；该方法可从50,000个人类胚胎干细胞中成功的鉴定到2,281个蛋白，为微量细胞样本的蛋白质组学样品前处理提供了新方法。陈等人在Simple andIntegrated Spintip-Based Technology Applied for Deep Proteome Profiling中公开了一种基于离心力的集成化的蛋白质组学分析技术(simple and integrated spintip-based proteomics Technology,SISPROT)，通过将SCX填料和C18填充在一个200μL枪头中，完成蛋白质预富集等样品前处理过程，方便地实现了高灵敏的蛋白质组学分析。

三维SISPROT技术(3D-SISPROT)是在SISPROT技术基础上发展起来的一种方法，其将所有样品制备步骤整合到一个装有SAX离子交换填料和C18膜的枪头中，并在SAX填料上完成蛋白质预富集、酶解和多肽分级操作。赵等人在Biphasic Microreactor forEfficient Membrane Protein Pretreatment with a Combination of Formic AcidAssisted Solubilization,OnColumn pH Adjustment,Reduction,Alkylation,andTryptic Digestion中利用蛋白质在SCX和SAX材料上富集的互补性，开发了基于SCX和SAX串联填充柱的双相微反应器，并通过模型蛋白牛血清白蛋白，肌红蛋白和细胞色素c的混合物评估该双相微反应器的富集效果，结果证实该方法可有效地减少蛋白样品的损失。

由于SAX或SCX填料的蛋白质富集效果有限，且富集的效果受pH影响较大，因此基于SAX或SCX填料的蛋白质组学方法受到一定限制

发明内容