[发明专利]一步法检测三唑磷残留的ELISA试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一步法检测三唑磷残留的ELISA试剂盒及其应用，所述试剂盒包括盒体、设在盒体内的酶标板以及试剂；其中，酶标板的每个孔包被有三唑磷包被抗原，所述试剂包括抗三唑磷VHH‑AP基因工程抗体、三唑磷标准溶液、缓冲液PBS、洗涤液PBST、显色液和反应终止液等。检测过程中，酶标板孔壁上吸附的包被抗原和待测三唑磷相互竞争与抗体反应，通过显色反应观察结果。本发明还提供一条用于构建VHH‑AP基因工程抗体的C端通用PCR引物。本发明的优点是能一步准确灵敏地检测出水、土壤和蔬菜中三唑磷的残留，样品前处理过程简单，耗时少，能同时检测大量样品，样品检测成本远低于现有检测方法，与传统ELISA试剂盒相比，样品检测所需时间大大缩短。

技术领域

本发明涉及基因工程、噬菌体展示技术以及ELISA检测技术领域，具体地说，涉及一步法检测三唑磷残留的ELISA试剂盒及其应用。

背景技术

三唑磷(Triazophos)是一种氨基甲酸酯杀虫剂，这类农药残留的常规检测主要是应用仪器分析法，包括气相色谱法(GC)和高效液相色谱法(HPLC)等。这些分析方法所需的仪器价格昂贵，样品的分离、提取、净化、衍生等前处理复杂，分析速度慢、检测灵敏度低，难以满足现场快速检测需求。许多理化分析技术本身存在局限性，如三唑磷的热稳定性差，难于用气相色谱法分析，而液相色谱尚缺乏选择性好的高灵敏度检测器等。随着待检样品、特别是要求现场快速检测样品量的迅速增加，传统的农药残留分析手段难以适应要求。

胆碱酯酶抑制法是利用有机磷和氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶的抑制作用原理而建立的一种农药残留检测方法，具有通用性强、简便快速等优点，一定程度上满足了现场检测需求，但其灵敏度低，在0.1-10mg/L范围内，难以满足痕量检测需求。因此，亟待开发一种高效农药残留快速分析技术。

基于常规抗体显色原理(HRP酶标二抗显色、2M硫酸终止反应)的三唑磷残留酶联免疫吸附分析方法，添加待测样品和标准品反应30-60min后，还需添加酶标二抗反应30-60min，步骤较多、耗时较长,且由于受到酶标二抗特异性和灵敏度的影响，具有稳定性相对较低的缺点。本发明以抗三唑磷VHH-AP基因工程抗体(纳米抗体与碱性磷酸酶定向偶联后的融合表达蛋白)为基础，采用一步法酶联免疫吸附分析方法，无需酶标二抗，添加样品和和标准品反应30-60min后即可直接显色。其检测效率、热稳定性均优于常规抗体显色原理的酶联免疫分析方法。

发明内容

本发明的目的是针对目前农药残留仪器分析方法成本高、前处理复杂、特异性差、灵敏度低和难以实验现场检测等缺点；常规ELISA检测试剂盒操作步骤较多、耗时较长且由于受到酶标二抗特异性和灵敏度的影响，具有稳定性相对较低等缺点，提供一种具有高特异性、高灵敏度、高准确度、高精确度、操作方法简单，并能用于大批量样品快速检测的，一步法检测三唑磷残留的ELISA试剂盒。

为了实现本发明目的，本发明首先提供一条用于构建VHH-AP基因工程抗体的C端通用PCR引物，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

继而本发明提供一种抗三唑磷VHH-AP基因工程抗体(噬菌体纳米抗体与碱性磷酸酶定向偶联而成的融合蛋白)，所述抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。例如，将SEQ ID NO:4所示序列去掉末端6个组氨酸标签后的氨基酸序列。

所述抗三唑磷VHH-AP基因工程抗体可以按如下方法进行制备：利用已筛选得到的特异性三唑磷噬菌体纳米抗体的序列(SEQ ID NO:1)，利用基因工程技术将其序列C端与碱性磷酸酶N端进行定向偶联，得到兼具二者功能的融合蛋白，将其表达纯化，得到灵敏度高，特异性强的抗三唑磷VHH-AP基因工程抗体。制备的VHH-AP基因工程抗体分子小，可溶性强，耐高温，易纯化，易表达，且在ELISA检测过程中无需HRP酶标二抗，加样反应后可直接显色。