[发明专利]一种硅橡胶固载化糜蛋白酶材料及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种硅橡胶固载化糜蛋白酶材料及其制备方法和应用，以糜蛋白酶为模型酶，用十一烯酰氯在磷酸缓冲液中修饰糜蛋白酶，利用硫‑烯点击化学的方法，将聚[3‑巯丙基甲基硅氧烷]、烯烃交联剂、经修饰的糜蛋白酶、光引发剂均匀混合，在紫外环境下光致交联固载化。本发明中固载化催化剂可以通过离心或者过滤的方法回收利用，耐高温性能较好，促多肽合成产率高，相比于原酶，重复利用稳定性有着显著提高。本发明制备方法简单，高效，成本廉价，利于工业上利用酶催化合成。

技术领域

本发明涉及一种硅橡胶固载化糜蛋白酶材料及其制备方法和应用，属于蛋白酶领域。

技术背景

多肽合成对于医疗、食品行业、科学研究有着至关重要的影响。蛋白酶催化合成多肽，相比于化学法合成多肽有着较多优点，比如高效性、立体专一性、条件温和易控等。原酶催化合成多肽有着诸多限制：(1)在水溶液中有着很高的催化活性，但难于回收利用，酶损失严重；(2)在有机溶剂中，酶的活性会大大降低，甚至于失活，没有实用价值；(3)酶浓度过高时会发生自溶现象。固载化酶不仅易回收利用，并且还能在有机溶剂中保持催化性能，大大简化提纯简化工艺，为大规模连续化生产提供了可能。因此，固载化酶技术的研究成为多肽工业中的研究热点。

利用化学法固载蛋白酶是近些年出现的一种新兴技术，它的主要优点在于固载化酶稳定性好、保持相对活性、固载效率高、易回收利用，适应了未来绿色化学的发展需要，引起了学术界和工业界的广泛关注。

文献(Journal of American Chemical Society,1995,117,4843-4850)报道了一种含有枯草杆菌蛋白酶的聚合物，其制备方法是将含有碳碳双键化合物修饰过后的聚乙二醇衍生物(PEG-A)接到枯草杆菌蛋白酶表面，然后利用热引发剂，在甲苯体系下将修饰后的枯草杆菌蛋白与含有末端烯烃的交联剂(MMA,TMA)发生聚合。含酶聚合物不仅在有机环境下保持高活性，并且在130℃处理后仍保持一定活性。其缺陷在于制备过程难度大，耗时长，原料损耗大。

文献(Chemical Reviews,2004,104,9)报道了交联的酶晶体(CLEC)的制备方法，比如利用丙二醛作为交联剂，利用蛋白酶表面的氨基进行交联制备得到交联酶晶体，其优点在于保持高活性，对pH和温度有着较好的稳定性，易回收，在有机溶剂中稳定等，而其制备过程比较复杂，并且原料耗费高，难以符合工业化要求。

文献(Chemical Communications,2010,46,2256-2258)报道了一种固载了CuCl催化剂的硅橡胶催化剂，其特征制备方法在于将含有末端双键的联吡啶加入聚甲基氢硅氧烷(PMHS)溶液中，通过铂催化的硅氢化反应交联形成硅橡胶，然后溶胀-化学吸附CuCl，实现固载化催化剂的目的。文献(RSC Advances,2015,5,7304)报道了一种固载有机催化剂的聚硅氧烷催化剂，其制备方法是将有机催化剂修饰为带末端双键，然后加入到含有交联剂、光引发剂(DMPA)、硅甲基硅烷(PMMS)混合溶液中，通过紫外引发反应交联形成橡胶，实现了对有机催化剂的固载。

发明内容

技术问题：本发明的目的在于提供一种硅橡胶固载化糜蛋白酶材料及其制备方法和应用，克服传统固载化酶工艺中固载方法复杂、成本较高、固载效率不好、重复利用率不高等缺点。

技术方案：本发明提供了一种硅橡胶固载化糜蛋白酶材料，该硅橡胶固载化糜蛋白酶材料的化学通式为：

A是糜蛋白酶，B是烯烃交联剂，x:y＝3：7～19。

其中：

所述的烯烃交联剂B的分子结构式为以下任意一种：

本发明还提供了一种硅橡胶固载化糜蛋白酶材料的制备方法，该方法通过硫-烯点击化学将糜蛋白酶单体用化学键合的方式接硅橡胶上，具体步骤如下：