[发明专利]一种鉴别肝螺杆菌的荧光定量PCR方法和荧光定量PCR试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种鉴别肝螺杆菌的荧光定量PCR方法和荧光定量PCR试剂盒。

背景技术

肝螺杆菌属于螺杆菌属，长约为1.5～5μm，呈革兰氏阴性，氧化酶、过氧化氢酶和尿素酶阳性。2003年，肝螺杆菌全基因组序列公布，全长1799146bp，与幽门螺杆菌和空肠弯曲杆菌的同源性为50％左右。肝螺杆菌的分离培养条件严格，需要在微需氧环境中生长、营养要求严苛、生长周期长，这些培养特性制约了肝螺杆菌的分离和鉴定。PCR方法是这类生长环境苛刻菌株首选的检测方法，在螺杆菌属和种水平上的高特异性和敏感性的PCR检测方法已经普遍用于啮齿类螺杆菌的检测中。如常规PCR的检测条件为：PCR反应体系为：10μM的上游引物1μL，10μM的下游引物1μL，Taq Mix 10μL，基因组DNA 1μL，dd H₂O 7μL；反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸15s，35个循环，最后72℃延伸5min。虽然采用常规PCR检测方法在一定程度上提高了检测肝螺杆菌的敏感性，但在灵敏度上仍存在不足。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术的不足，而提供一种鉴别肝螺杆菌的荧光定量PCR方法，荧光定量PCR在反应体系中加入与DNA双链结合的荧光染料，通过荧光信号的改变，实时荧光定量PCR仪能够灵敏的分析PCR扩增的变化，提高检测结果的灵敏度。

本发明提供了一种鉴别肝螺杆菌的荧光定量PCR方法，将包含有PCR引物的反应体系进行荧光定量PCR反应；

所述PCR引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

所述反应体系每20μL包括以下组分：10μM的上游引物0.8μL，10μM的下游引物0.8μL，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10μL，ROX Reference Dye Ⅱ 0.4μL，样品DNA模版1μL，ddH₂O 7μL；

所述荧光定量PCR反应的程序包括：95℃预变性30s，95℃5s，52℃30s，72℃30s，40个循环，95℃15s，60℃1min，95℃15s；

当Ct值小于33时，检测出肝螺杆菌，当Ct值大于等于33时，未检测出肝螺杆菌。

本发明还提供了一种荧光定量PCR试剂盒，包括：上游引物、下游引物、SYBR Premix Ex Taq II、ROX Reference Dye II和阳性质控品；

所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。

优选的，所述上游引物的体积为200～600μL，下游引物的体积为200～600μL，SYBR Premix Ex Taq II的体积为3～7ml，ROX Reference Dye II的体积为100～300μL，阳性质控品的体积为1～3ml。

优选的，所述上游引物的浓度为10μM；

所述下游引物的浓度为10μM。

本发明实施例的结果显示：采用本发明的荧光定量PCR方法，最低检测限为5拷贝/μL，采用常规PCR方法，最低检测限为5.0×10³拷贝/μL，与常规PCR方法相比，灵敏度提高了1000倍。

附图说明

图1：2％琼脂糖凝胶电泳检测普通PCR引物特异性结果，条带大小为183bp，1为肝螺杆菌阳性样品，2为胆螺杆菌阴性对照，3为啮齿类螺杆菌阴性对照，4为空白对照，M为DL2000Marker；

图2：2％琼脂糖凝胶电泳检测普通PCR敏感性结果，M为DL2000Marker，1为5.0×10⁹拷贝/μL，2为5.0×10⁸拷贝/μL，3为5.0×10⁷拷贝/μL，4为5.0×10⁶拷贝/μL，5为5.0×10⁵拷贝/μL，6为5.0×10⁴拷贝/μL，7为5.0×10³拷贝/μL，8为5.0×10²拷贝/μL，9为50拷贝/μL，10为5.0拷贝/μL，11为0.5拷贝/μL，12为空白对照；

图3：荧光PCR溶解曲线分析图；