[发明专利]口蹄疫抗原146S浓缩纯化方法

说明书

本发明公开了口蹄疫抗原146S浓缩纯化方法，包括：先将口蹄疫病毒培养液离心至澄清，在无菌条件下加二氯甲烷，搅拌均匀，在低温下沉降，过夜，取上清液；过大、小孔径的中空纤维，然后层析，按照浓度为7‑10％的比例加入PEG，搅拌；静置；提取上清液并弃去，将沉淀后的抗原搅拌均匀，无菌下灌装至离心桶内，沉降离心；弃上清液，沉淀物用pH值为7.6±0.2的PBS缓冲液稀释，重悬；重悬液用分散机充分匀浆；纯化离心，收集上清液，上清液为纯化抗原；纯化抗原用0.22μm孔径滤器过滤除菌，然后用适量PBS液冲洗滤器和管路。本发明采用二氯甲烷浓缩纯化口蹄疫抗原，比传统的氯仿安全性更好，并且纯化后杂蛋白含量较低。采用二氯甲烷把较大的杂蛋白除去，中控纤维去除特定大小的蛋白颗粒，Sephawse 6FF层析、TOYOPEARL、TSKgel离子交换层析进一步去除特定大小蛋白进一步提高目标蛋白纯度，PEG只抓取目标物(口蹄疫抗原)，相当于再次除去杂蛋白结构，使得口蹄疫抗原浓缩纯化的效果更好。

技术领域

本发明涉及抗原浓缩纯化技术领域，具体涉及一种口蹄疫抗原146S浓缩纯化方法。

背景技术

口蹄疫(foot and mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒引起的偶蹄动物的一种烈性人畜共患的急性接触性传染病，在世界许多国家和地区广泛流行。由于猪、牛、羊等均可感染此疾病，并能形成全球大规模流行，所以被国际兽疫局是最重要的动物传染病，该病在亚洲、非洲、南美洲的流行极大的限制了这些地区的肉品及其它农产品的出口,阻碍了这些地区的畜牧业、畜产品加工业的发展。口蹄疫严重危害畜牧业的发展,给牧区造成严重经济损失，也可使对外贸易和旅游业遭受惨重损失。2001年英国暴发口蹄疫损失约90亿英镑，绵羊是此病的有力传播者；我国部分地区于2005年及2009年分别暴发Asia I型和A型FMD，不仅造成了巨大的直接经济损失，而且严重危害奶业的健康发展以及相关产品的对外贸易。

接种疫苗是预防该病的重要手段之一，而研制高质量、安全有效的疫苗，不但是决定疫苗免疫效果的关键，也是成功预防、控制直至最终消灭口蹄疫的先决条件。口蹄疫疫苗生产工艺复杂，特别是抗原的纯化工艺尤其重要，146S抗原是口蹄疫疫苗免疫原性起决定性作用的的抗原，比较脆弱，容易破碎或裂解，会导致免疫原性丧失或下降。口蹄疫病毒培养液中有效抗原(146S抗原)含量较低，疫苗注射后免疫持续期短，疫苗免疫效力不稳定。为提高疫苗的免疫效力，通常采用对抗原浓缩纯化。但浓缩的同时，非目的蛋白也会被浓缩，导致不良反应增加。疫苗中的较高的非目的蛋白成分会造成动物在注苗后出现不同程度的不良反应，轻者减食或停食2-3天或发生流产，重者发生死亡。疫苗中的非目的蛋白包括培养细胞时残留的血清，细胞蛋白和口蹄疫病毒的非结构蛋白，为降低不良反应需要对疫苗进行纯化。

目前，对口蹄疫病毒纯化主要是通过中空纤维过滤达到除去细胞碎片、非结构蛋白等，氯仿去除非目的蛋白，纯化过程口蹄疫抗原损失较大。现阶段对于口蹄疫抗原纯化主要通过过滤除去大颗粒蛋白，过滤过程损失较大；氯仿除非目的蛋白工艺中氯仿毒性较大，每立方米可能会对人体产生慢性毒性的最小浓度10毫升。因此，现在常用的口蹄疫抗原浓缩纯化的方法已经不能适用于口蹄疫疫苗的发展。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的以上问题，提供一种口蹄疫抗原146S浓缩纯化方法，本发明采用二氯甲烷替纯化口蹄疫抗原，纯化过程不经过过滤抗原损失较小。

为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：

口蹄疫抗原146S浓缩纯化方法，包括以下步骤：

S101先将口蹄疫病毒培养液离心至澄清，在无菌条件下加二氯甲烷，搅拌均匀，在低温下沉降，过夜，取上清液；

S102将上清液过第一中空纤维进行过滤，收集透过液；

S103将透过液过第二中空纤维进行过滤，所述第二中空纤维的孔径比所述第一中空纤维的孔径小，收集回收液；