[发明专利]一种人类线粒体全长单倍型测定及遗传变异分析方法

说明书

技术领域：

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种获得人类线粒体基因组以及线粒体全长单倍型的测定和变异分析的方法。

背景技术：

线粒体是细胞内的能量工厂，它具有自身的一套DNA(mtDNA)，通过母亲的卵子传递给下一代。除了红血细胞外，其存在于人体内的每一个细胞中，线粒体的主要功能是提供细胞所需要的能量-三磷酸核苷酸(ATP)。人线粒体DNA(mtDNA)，共包含37个基因，这37个基因中有22个编码转移核糖核酸(tRNA)、2个编码核糖体核糖核酸(12S和16S rRNA)，13个编码多肽。线粒体与许多人类疾病相关，线粒体疾病的发生是由于线粒体的功能不正常而导致的一些疾病，发生在卵子中的线粒体突变可能引起母系家族性疾病。这种突变会导致严重的问题，受影响的大多数是能量需求高的器官，例如肌肉、大脑、心脏，涉及到一系列广泛的母源性遗传病线粒体疾病，目前临床只能选择少数常见的线粒体基因位点进行突变和缺失筛查，阳性率很低，大多数患者难以获得准确的病因诊断。

线粒体不仅仅与许多人类疾病息息相关，而且在人类母系起源研究、法医学、考古学等方面研究都具有重要的影响。为了获得更多更有价值的信息，能否利用线粒体全基因组单倍型信息是一个重要环节。传统的方法是将线粒体基因组一小段、一小段的进行扩增，然后拼接测序，一代测序过程中需要几十对引物，相对费时费力，二代测序需要用大量的小片段进行拼接，而线粒体基因组中存在假基因、大片段缺失或大片段重复用时，用二代测序更无法进行准确的拼接。为此，申请人提出一种依托SMRT测序技术对人类线粒体全长单倍型信息进行测定，建立线粒体全基因组变异分析的方法。

发明内容：

本发明的目的旨在提供一种基于SMRT测序技术获得人类线粒体基因组以及线粒体全长单倍型的测定和变异分析的方法。

本发明的方法主要是通过引物扩增一次性获得人类线粒体基因组的模板，然后通过SMRT测序技术获得线粒体全长序列，再将获得的序列进行生物信息学分析，从而得到变异信息。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：

一种人类线粒体全长单倍型测定及遗传变异分析方法，具体包括如下步骤：

1)提取人线粒体全基因组DNA；

2)通过一对引物进行PCR扩增获得线粒体全基因组DNA模板，即PCR产物；

3)将获得的所有PCR产物均匀混合形成DNA池；

4)将DNA池通过SMRT测序技术构建成20K文库后，于PacBio RSⅡ测序仪上进行测序及序列多态性分析，即可获得线粒体遗传变异信息。

上述PCR扩增的引物为：

正向引物序列为：5’-GTACCCTAACCCGTGCAAAGGTAGCATA-3’，

反向引物为：5’-ACAGGTCCCTATTTAAGGAACAAGTGAT-3’。

本发明的有益效果在于：本发明基于SMRT测序技术具有读长长(可达16k以上)、测序结果无系统性误差、可以克服重复序列和高GC含量序列等优势，不仅可以对获得的人类线粒体基因组的线粒体全长单倍型进行测定，并且通过序列多态性等分析，可以获得更多更有价值的线粒体遗传变异信息，对应用于人类疾病作出准确的病因诊断方面具有重要的意义。因此，本发明的方法可适用于人类所有线粒体相关疾病DNA全长单倍型的测定需求和法医学研究应用中对线粒体全长单倍型测定的需求。

附图说明：

图1是本发明实施例1中PCR扩增产物的电泳图；

图2是本发明实施例1中序列分析保存的序列对齐比对图。

具体实施方式：

下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。

实施例1

按照Qiagen全基因组核酸提取试剂盒使用说明，对外周血样本提取基因组DNA；总共采集15个不同人的外周血样品。

1.外周血样本DNA的提取：

1)按样本编号排好EP离心管，并标记；

2)向每个1.5ml的EP管中加入PK酶溶液20ul，然后分别加入外周血样本200ul；

3)向每个EP管中加入蛋白酶K液200ul，盖好EP管盖，在漩涡振荡器上振荡15秒，随后瞬时离心；

4)将各EP管放入悬浮泡沫孔中，置于56℃水浴箱中10-30min，期间可适当翻转；

5)取出各离心管，瞬时离心后，向各管中加入无水乙醇200ul，振荡混匀15秒，瞬时离心；