[发明专利]基于二氧化钛修饰多孔硅在线富集和检测S层蛋白的生物芯片传感器及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物检测，具体涉及一种基于二氧化钛修饰多孔硅在线富集和检测嗜酸乳杆菌S层蛋白的生物芯片传感器及其制备方法和应用。

背景技术

S-层蛋白是存在于细胞膜或细胞壁外的一种表层蛋白，是一类由蛋白质亚基组成的单层晶体结构，有多种乳酸菌表面存在S-层蛋白。嗜酸乳杆菌是黏附于肠道内的一种功能性益生菌，其表面的S-层蛋白在黏附中起到重要作用，对嗜酸乳杆菌发挥益生功能有重要贡献；S-层蛋白可以和肠上皮细胞表面的受体结合，阻断致病菌与病毒与其结合，因此对致病菌与病毒有一定抑制作用。对S- 层蛋白进行快速、有效的富集和检测可推进其进一步的研究。目前对S-层蛋白的检测技术主要有质谱技术、氨基酸组分分析技术等，这些方法成本较高且操作复杂。因此开发一种操作简便、准确快速且高效的富集和检测方法十分重要。

多孔硅是使用单晶硅制备得到的具有海绵状结构的材料，多孔硅的光学特性使之在传感器方面具有很大应有价值，主要表现在其具有良好的反射性能，因此传感器可以基于这一点进行光信号的检测；另外由于多孔硅有其他许多不可多得的优点，如具有极大的比表面积、可在室温下发射可见光、化学稳定性良好、具有良好的生物兼容性等，也使其在传感器方面受到了广泛的研究应用。但是现有的孔硅非标记检测技术的稳定性差对复杂样品中S层蛋白不能进行特异性富集和检测，且没有报道。

发明内容

发明目的：针对现有技术存在的缺陷，如本发明所述的一种基于二氧化钛修饰多孔硅在线富集和检测S层蛋白的生物芯片传感器，该生物芯片传感器可以有效地、高选择性地富集和检测S-层蛋白。

本发明还提供基于二氧化钛修饰多孔硅在线富集和检测S层蛋白的生物芯片传感器的制备方法和应用。

技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述一种基于二氧化钛修饰多孔硅在线富集和检测S层蛋白的生物芯片传感器，由二氧化钛修饰的多孔硅为载体，通过微流控技术结合，利用A蛋白将S-层蛋白单克隆抗体定向固定于二氧化钛修饰的多孔硅表面制备得到。

本发明所述的生物芯片传感器的制备方法，包括以下步骤：

(1)多孔硅的制备：采用阳极氧化法将硅片制备得到多孔硅，并进行高温氧化处理；

(2)二氧化钛修饰多孔硅：将钛酸四丁酯、无水乙醇、三乙醇胺混合均匀，用旋涂法将其涂布于步骤(1)所得的多孔硅表面，接着对多孔硅进行高温氧化处理，该步骤重复2-3次；

(3)抗体的固定：将步骤(2)所得二氧化钛修饰的多孔硅固定于微流控装置，匀速泵入A蛋白溶液使其非共价吸附于多孔硅表面，接着泵入S-层蛋白单克隆抗体溶液，使其被A蛋白捕获，通过A蛋白定向固定抗体的方法将S-层蛋白单克隆抗体固定于二氧化钛修饰的多孔硅表面，得到生物芯片传感器。

其中，步骤(2)所述的钛酸四丁酯、无水乙醇、三乙醇胺体积比5-6:30:1-2。优选体积比为5:30:1。

进一步地，步骤(2)所述的钛酸四丁酯、无水乙醇、三乙醇胺的混合溶液按质量体积比100-120：50(ul/mg)滴在多孔硅表面。作为优选，混合溶液按质量体积比100：50(ul/mg)按片滴在多孔硅表面。

其中，步骤(3)所述微流控装置由样品池和恒流泵构成；二氧化钛修饰的多孔硅固定于样品池底部使液体流经多孔硅表面，由恒流泵提供稳定的流速。恒流泵一端连接装样品的离心管，另一端连接样品池，这样可使样品循环流动经过多孔硅表面，便于蛋白的粘附和检测。使用光纤光谱仪检测多孔硅表面的干涉反射峰，保持光源固定检测多孔硅表面一点，以免光源移动使检测结果产生误差。微流控装置的样品池材料为聚甲基丙烯酸甲酯，厚度8mm，宽度30mm，长度 60mm，中间孔径1.5mm，孔径总成长80mm，进出槽孔径由管径1.4mm不锈钢管连接，不锈钢管连接内孔径1.3mm，管壁后1.6mm的硅胶管，样品槽直径 5.0mm，光纤垂直多孔硅表面检测。所述生物芯片传感器由微流控装置和固定 S-层蛋白单克隆抗体固定于二氧化钛修饰的多孔硅构成。

步骤(3)所述A蛋白溶液浓度为0.1-0.2mg/mL；S-层蛋白单克隆抗体溶液浓度为50-55μg/mL。作为优选，A蛋白溶液浓度为0.1mg/mL；S-层蛋白单克隆抗体溶液浓度为50μg/mL。

本发明所述的生物芯片传感器在线富集和检测S层蛋白中的应用。

进一步地，所述生物芯片传感器在线富集和检测嗜酸乳杆菌中S层蛋白。