[发明专利]一种单波长激发双信号增强的Hg2+荧光比率法

说明书

本发明涉及一种单波长激发双信号增强的Hg²⁺荧光比率法，属于化学/生物传感及分析检测技术领域，具体地，向含有Mg²⁺的缓冲溶液中加入单链DNA分子A、单链DNA分子B、NMM和DAPI，得混合液Ⅰ，其中，分子A由Ⅰ和Ⅱ两部分组成，分子B由Ⅲ和Ⅳ两部分组成，分子A的部分Ⅰ和分子B的部分Ⅲ是含有T‑T碱基错配的部分互补序列，分子A的部分Ⅱ和分子B的部分Ⅳ是能形成四链体的富G序列；向混合液Ⅰ中加入Hg²⁺，振荡，测定荧光强度；其中，测量范围为400‑700 nm，激发波长为380 nm。该方法是一种双信号增强的新型Hg²⁺比率型荧光分析法，用于对样品中Hg²⁺的检测，选择性、准确度和可靠性都较高。

技术领域

本发明属于化学/生物传感及分析检测技术领域，具体地涉及一种单波长激发双信号增强的Hg²⁺荧光比率法。

背景技术

Hg²⁺是一种重金属离子，Hg²⁺污染不仅影响环境，也严重威胁人类健康，因此，Hg²⁺的定量分析具有重要意义。荧光传感器具有灵敏度高、择性好、方法简便、快速响应、无损伤、实时检测等特点，与化学发光法、比色法和电化学分析方法相比，荧光分析法在Hg²⁺定量分析中具有明显的优势。

在过去几十年里，人们开发出许多的Hg²⁺荧光传感体系。这些传感器大多都是单一波长激发，最大发射波长不发生移动，以单一波长处荧光强度变化作为定量分析参数，虽然其操作简单、直观、可视化强，但是定量检测时很容易受到探针浓度、试样所处环境以及荧光漂白、散射和背景光等的干扰，所以单波长检测方法在复杂样品中准确测定方面还面临巨大挑战。比率型荧光分析法，又称荧光比率法，是根据两个不同波长处的荧光强度比值来测定目标物，具有自校正作用。因此，可排除受体及被检测物种的环境干扰，并扩大检测范围，提高对复杂体系进行定量分析的准确度。

近年来也已经报道了许多比率型荧光探针并广泛应用于各种分析物的检测。常见的构建比率型荧光检测体系的方法有荧光共振能量转移(FRET)、二聚体形成、激发态质子转移、纳米粒子等。现有的探针普遍存在着水溶性差、生物相容性差等缺点，而DNA具有水溶性好、生物相容性好等特点，广泛应用于荧光传感器的构建。例如，Huang等利用DNA 修饰的AuNPs和双荧光团标记的i-motif序列DNA探针设计了一种基于FRET的比率型荧光探针并用于活细胞内pH值的传感。虽然该类标记型方法灵敏度高、响应速度快，但是通常需要繁琐的功能化或标记过程，同时也提高了成本。而基于DNA荧光染料的免标记DNA 生物传感器方法简单、成本低，已成为生物化学和环境分析的研究热点。DNA荧光染料主要有两类。一是能与dsDNA结合并且荧光信号大大增强的染料。二是能够嵌入G-四链体后荧光信号大大增强的染料。例如，汪尔康院士课题组利用Cu²⁺与NMM的结合作用发展了一种可以同时检测组氨酸(His)和半胱氨酸(Cys)的免标记传感方法。Chen等基于Tb³⁺诱导ThT/G-四链体构型转换释放出ThT染料实现了Tb³⁺的高灵敏度检测。2016年，Cheng等基于K⁺置换Na⁺-PPIX的G-四链体中Na⁺成功应用于检测活体老鼠脑部细胞、肿瘤细胞中的K⁺和PPIX。相比于双波长检测方法，这些单波长荧光检测方法容易受干扰，准确度不高。 2017年，Guo等利用DAPI和NMM两种DNA结构特异性染料构建了一种新型的免标记比率型荧光传感器。这两种染料的激发光谱相互重叠，可以在同一激发波长处测定双波长信号，测量简单方便。但是检测过程中DAPI信号增强而NMM的信号降低，相对于荧光猝灭，人们更乐意开发荧光增强型的分析方法。但由于技术的局限性，两个波长处的荧光同时增强的比率型荧光分析法难以实现。

发明内容