[发明专利]一种肿瘤组织TIL细胞制备方法及专用培养基

权利要求书

1.一种肿瘤组织TIL细胞制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

1)在无菌条件取得瘤旁组织，用氯化钠注射液进行冲洗,并剪除坏死及结缔组织；

2)将步骤1)所得的瘤旁组织切成1-2mm³碎块，加入0.1％I型胶原酶于4℃条件下过夜，次日再加入0.1mg/ml透明质酸酶I和10ul/ml DNA酶，于35-38℃消化3-5h，得到细胞悬液，然后将所述细胞悬液过滤，收集滤液，离心弃上清，得单细胞悬液；

3)向步骤2)所得的单细胞悬液中加入原代培养基，吹打混匀，细胞计数，调整细胞密度为1-2×10⁶个/ml，接种于培养瓶中，并将细胞均匀分布于整个底面，放置于二氧化碳恒温恒湿培养箱中，于37±0.5℃，二氧化碳体积分数为5±0.2％的条件下，培养7-10天；

4)然后更换传代培养基，每隔2-5天更换传代培养基，继续培养11-15天，收集细胞，即得所述肿瘤组织TIL细胞；

所述原代培养基以RPMI 1640培养基为基础，包含以下浓度组分：10％体积的人源血清、20-45ng/ml的bFGF、1-5mg/ml的核黄素、70-90ng/ml的皮质醇、10-25mg/ml的一水磷酸二氢钠、47-62ng/ml的LIF、500-800U/ml的IL-2；

所述传代培养基以RPMI 1640培养基为基础，包含以下浓度组分：10％体积的人源血清、20-40mmol/L的HEPES、1000-2000U/ml的IL-2、0.03-0.07mmol/L的β-巯基乙醇、5-15ng/ml磷酸钠。

2.如权利要求1所述的肿瘤组织TIL细胞制备方法，其特征在于，所述原代培养基还包括18-26μg/ml的苯丙氨酸、300-500μg/ml的硫酸化糖胺聚糖。

3.如权利要求1所述的肿瘤组织TIL细胞制备方法，其特征在于，所述传代培养基还包括18-28μg/ml的硫酸软骨素蛋白聚糖。

4.如权利要求1-3任一所述的肿瘤组织TIL细胞制备方法，其特征在于，所述步骤3)的培养方法具体为，培养第1天的所述原代培养基中加入浓度为1000U/ml的IFN-r和15ng/ml胰岛素，于培养第2天向培养基的所述原代培养基中加入浓度为100ng/ml的OKT₃、1000U/ml的IL-2和21ng/ml的PDGF。

5.如权利要求1所述的肿瘤组织TIL细胞制备方法，其特征在于，在步骤3)和步骤4)的培养过程中，以48小时为单位,调整细胞浓度为1-3×10⁶个/ml。

6.如权利要求1所述的肿瘤组织TIL细胞制备方法，其特征在于，所述细胞收集的具体方法为：轻轻摇晃培养瓶，将细胞悬液转移至离心管中，1500rpm的速度离心5min，弃上清，然后加入沉淀稀释液将细胞沉淀稀释，混匀，然后以1500rpm的速度进行离心，即可收集到所述肿瘤组织TIL细胞。

7.如权利要求6所述的肿瘤组织TIL细胞制备方法，其特征在于，所述沉淀稀释液为包含浓度为：80-120mg/ml的D-葡萄糖和22-31mg/ml的青链霉素的0.9％氯化钠注射液。

8.一种用于培养肿瘤组织TIL细胞的专用培养基，其特征在于，所述培养基包括原代培养基和传代培养基，其中，所述原代培养基以RPMI1640培养基为基础，包含以下浓度组分：10％体积的人源血清、20-45ng/ml的bFGF、1-5mg/ml的核黄素、70-90ng/ml的皮质醇、10-25mg/ml的一水磷酸二氢钠、47-62ng/ml的LIF、500-800U/ml的IL-2；所述传代培养基以RPMI 1640培养基为基础，包含以下浓度组分：10％体积的人源血清、20-40mmol/L的HEPES、1000-2000U/ml的IL-2、0.03-0.07mmol/L的β-巯基乙醇、5-15ng/ml磷酸钠。