[发明专利]一种肿瘤组织TIL细胞制备方法及专用培养基

说明书

本发明涉及肿瘤组织TIL细胞制备方法及专用培养基，所述方法包括：瘤旁组织获取、细胞消化、细胞原代培养、细胞传代培养和细胞收集步骤，其中，原代培养基为以RPMI 1640培养基为基础，包含以下浓度组分：10％体积的人源血清、20‑45ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、1‑5mg/ml的核黄素、70‑90ng/ml的皮质醇、10‑25mg/ml的一水磷酸二氢钠、47‑62ng/ml的重组人白血病抑制因子(LIF)、500‑800U/ml的IL‑2；传代培养基为以RPMI 1640培养基为基础，包含以下浓度组分：10％体积的人源血清、20‑40mmol/L的HEPES、1000‑2000U/ml的IL‑2、0.03‑0.07mmol/L的β‑巯基乙醇、5‑15ng/ml磷酸钠。对现有培养基进行了改良，采用不同的培养基对TIL细胞进行针对性培养，提高TIL细胞的扩增能力，同时减少培养周期，降低培养复杂程度，减少了IL‑2的使用量，从而降低毒性反应。

技术领域

本发明属于细胞培养领域，特别涉及一种肿瘤组织TIL细胞制备方法及专用培养基。

背景技术

肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)是从肿瘤组织中或肿瘤患者胸腹水分离出来的淋巴细胞，这种细胞在体外经白细胞介素Ⅱ(IL-2)刺激后可大量增殖，这种刺激后增殖的TIL细胞又称之为“肿瘤来源的激活细胞”。TIL治疗除适用于实体瘤患者外，同样适应于各类晚期胸、腹水的癌症患者,因其靶向性高、特异性强、毒性作用小、疗效显著等优势已成为一种有效的新型免疫治疗方法,为过继免疫治疗提供一条更为简便的途径，对晚期癌症患者提供了一种新的治疗手段。

上个世纪八十年代，Rosenberg教授首次分离肿瘤组织中的TIL细胞，并通过白细胞介素2的刺激来解除其免疫抑制状态，体外扩增后，用于回输治疗黑色素瘤患者，并取得了一定的效果。但是，由于使用传统方法，体外诱导TIL的效率太低，操作过程复杂，扩增时间长，且扩增数量有限，增殖倍率低；不同患者间培养出的细胞数存在很大的差异，很多患者的细胞经过培养在短期内无法达到临床治疗要求的细胞数；国内外常用的培养方法需要40～50天，且TIL细胞中CD3⁺CD8⁺T细胞的杀伤能力不高，因此往往达不到预期治疗效果，临床应用受到很大限制，真正能用于肿瘤患者临床治疗的可行方案并不多。

科研工作者不断探索培养TIL的新方法，比如在培养中期添加抗CD3单克隆抗体、使用炎性因子等。因此，尽早建立一种高效扩增TIL细胞的方法，已成为国内外学者研究工作的目标。

发明内容

本发明的特征在于在前人研究的基础上，提供了一种肿瘤组织TIL细胞制备方法，可有效的对肿瘤组织TIL细胞进行体外培养和扩增。

为实现上述目的，本发明具体技术方案如下：

一种肿瘤组织TIL细胞制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

1)在无菌条件取得瘤旁组织，用氯化钠注射液进行冲洗,并剪除坏死及结缔组织；

2)将步骤1)所得的瘤旁组织切成1-2mm³碎块，加入0.1％I型胶原酶于4℃条件下过夜，次日再加入0.1mg/ml透明质酸酶I和10ul/ml DNA酶，于35-38℃消化3-5h，得到细胞悬液，然后将所述细胞悬液过滤，收集滤液，离心弃上清，得单细胞悬液；

3)向步骤2)所得的单细胞悬液中加入原代培养基，吹打混匀，细胞计数，调整细胞密度为1-2×10⁶个/ml，接种于培养瓶中，并将细胞均匀分布于整个底面，放置于二氧化碳恒温恒湿培养箱中，于37±0.5℃，二氧化碳体积分数为5±0.2％的条件下，培养7-10天；

4)然后更换传代培养基，每隔2-5天更换传代培养基，继续培养11-15天，收集细胞，即得所述肿瘤组织TIL细胞。