[发明专利]一种I群4型禽腺病毒DNA疫苗及其制备方法和应用有效

专利信息
申请号: 201710668978.9 申请日: 2017-08-08
公开(公告)号: CN107432930B 公开(公告)日: 2020-10-20
发明(设计)人: 张星;刘渝;李成山;刘涛;汪鑫鑫;商俊 申请(专利权)人: 安徽东方帝维生物制品股份有限公司
主分类号: A61K39/235 分类号: A61K39/235;A61P1/16;A61P31/14;C12N15/34;C12N15/79
代理公司: 合肥市浩智运专利代理事务所(普通合伙) 34124 代理人: 王志兴
地址: 233500 安徽*** 国省代码: 安徽;34
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摘要:
搜索关键词: 一种 型禽腺 病毒 dna 疫苗 及其 制备 方法 应用
【权利要求书】:

1.一种I群4型禽腺病毒DNA疫苗,其特征在于,所述I群4型禽腺病毒DNA疫苗含有I群4型禽腺病毒五邻体基因;

其通过以下方法制备,包括以下步骤:

(1)使用PCR的方法扩增出目的片段,设计一对带有EcoR ISal I酶切位点的I群4型禽腺病毒五邻体基因的特异性引物,以I群4型禽腺病毒DNA 为模板,扩增出五邻体基因片段;

(2)将五邻体基因片段连接到pMD-18T载体,通过测序对序列进行验证;

(3)采用酶切连接的方法,将五邻体基因连接到真核表达载体pCI上;

(4)将pCI-penton转染进LMH细胞,通过Western-blot鉴定是否表达penton蛋白;

(5)将(4)中能够正确表达penton蛋白的pCI-penton质粒进行大量扩增并进一步提取纯化重组真核表达质粒pCI-penton,用作I群4型禽腺病毒DNA疫苗;

所述步骤(1)中一对带有EcoR ISal I酶切位点的I群4型禽腺病毒五邻体基因的特异性引物分别为:

引物1:5'-CGGAATTCATGTGGGGGTTGCAGCCG-3';

引物2:5'-GTCGACGTCGCGGAACTCAGAACGGT-3';

所述步骤(3)中酶切采用EcoR ISal I双酶切;

所述I群4型禽腺病毒五邻体基因的序列如SEQ ID No.1所示。

2.根据权利要求1所述的I群4型禽腺病毒DNA疫苗,其特征在于,所述步骤(1)中进行五邻体基因片段PCR扩增的反应体系为:一对引物各1 μl,模板DNA 2 μl,LA Taq 1 μl,10×PCR Buffer 10 μl,dNTP Mix 4 μl,ddH2O 31 μl;反应条件为:94℃ 5 min,94℃变性50s,58℃退火45 s,72℃延伸1 min 30 s,35个循环,72℃延伸10 min。

3.一种制备如权利要求1-2任一项所述的I群4型禽腺病毒DNA疫苗的方法,其特征在于,包括如下步骤:

(1)使用PCR的方法扩增出目的片段,设计一对带有EcoR ISal I酶切位点的I群4型禽腺病毒五邻体基因的特异性引物,以I群4型禽腺病毒DNA 为模板,扩增出五邻体基因片段;

(2)将五邻体基因片段连接到pMD-18T载体,通过测序对序列进行验证;

(3)采用酶切连接的方法,将五邻体基因连接到真核表达载体pCI上;

(4)将pCI-penton转染进LMH细胞,通过Western-blot鉴定是否表达penton蛋白;

(5)将(4)中能够正确表达penton蛋白的pCI-penton质粒进行大量扩增并进一步提取纯化重组真核表达质粒pCI-penton,用作I群4型禽腺病毒DNA疫苗。

4.根据权利要求3所述的I群4型禽腺病毒DNA疫苗的制备方法,其特征在于,所述步骤(5)中使用质粒提取试剂盒对重组真核表达质粒DNA疫苗进行提取纯化。

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