[发明专利]一种I群4型禽腺病毒DNA疫苗及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种I群4型禽腺病毒DNA疫苗，其抗原含I群4型禽腺病毒五邻体基因。本发明还公开了一种I群4型禽腺病毒DNA疫苗的制备方法和应用，制备方法为：(1)设计带有EcoR I和Sal I酶切位点的I群4型禽腺病毒五邻体基因引物，以I群4型禽腺病毒DNA为模板，扩增目标基因片段；(2)将五邻体基因片段连接到pMD‑18T载体；(3)将五邻体基因连接到真核表达载体pCI；(4)将pCI‑penton转染进LMH细胞；(5)扩增并提取纯化pCI‑penton。本发明的优点在于：制备简单、使用方便、成本低；能同时激发体液免疫与细胞免疫，对SPF鸡提供有效的全面保护；不存在毒力返强的风险。

技术领域

本发明涉及DNA疫苗技术领域，尤其涉及一种I群4型禽腺病毒DNA疫苗及其制备方法和应用。

背景技术

禽腺病毒(Fowl adenovirus，FAdV)属于禽腺病毒科禽腺病毒属，根据其抗原性差异分为3个群：I群、II群和III群。1987年在巴基斯坦安卡拉地区的肉鸡场爆发了以心包积液为特征的疾病，给当地的养鸡业带来了巨大的损失，随后在德国、印度、伊朗、墨西哥和日本等地的肉鸡群也相继爆发了以心包积液-包涵体肝炎综合征为特征的疾病，死亡率可达到80％以上，经过研究证实，这些地区的心包积液-包涵体肝炎综合征均是由I群4型禽腺病毒引起。I群禽腺病毒有12个血清型，具有共同的群特异性抗原，该群病毒普遍存在于鸡、鸭和鹅等禽体内，呈现隐性感染，常作为继发病原使家禽患病，本病既可以垂直传播也可以水平传播。能够引起鸡心包积液-包涵体肝炎综合征的主要是I群4型禽腺病毒。2009年之前，禽腺病毒病在我国呈现散发流行，自2009年以后，禽腺病毒病的流行呈现上升趋势，2015年，在我国安徽、河南和山东等省份的鸡群中爆发了心包积液-包涵体肝炎综合征，这种疾病的特点是心包中具有透明状或者黄色液体，心肌纤维中间浸润大量血细胞和淋巴细胞，肝脏肿大，表面出现坏死灶，病理组织学观察肝脏脂肪变性，单核细胞浸润，肝小叶中央部位细胞弥散性肿胀，肝脏实质中常见肝细胞坏死而形成不规则的坏死灶，肝细胞内可见有嗜碱性包涵体存在，有时可见肾脏间质血细胞浸润，肾小管上皮细胞出现坏死，脾脏呈现大量的粒细胞浸润，引起的死亡率甚至可达100％，给养殖业造成巨大的经济损失。

国内尚无商品化疫苗用来防控I群4型禽腺病毒疾病，现由青岛易邦生物工程有限公司、扬州大学等单位研制的I群4型禽腺病毒疫苗均已进入临床试验阶段，但其使用细胞培养法或鸡胚培养法增殖病毒，培养难度大，病毒滴度低，生产成本较高，不利于推广。另外，国外商品化的I群4型禽腺病毒疫苗使用鸡胚生产，同样存在病毒增殖滴度低，生产成本高，不易推广等问题。且不论国内正在研发的I群4型禽腺病毒疫苗，还是国外已上市的I群4型禽腺病毒疫苗，均为灭活疫苗，免疫鸡体后，其抗体产生慢，只能诱导体液免疫，而不能引起细胞免疫，保护效率较低。因此，急需开发一种新型I群4型禽腺病毒疫苗用于防控本病。

DNA疫苗又称核酸疫苗、基因疫苗，是近年来随着基因技术的发展而产生的一种新型疫苗。DNA疫苗是指将编码特异性抗原多肽或蛋白质的基因插入到合适的质粒中，导入动物机体，诱导动物免疫系统对编码抗原基因在体内表达的多肽或蛋白质发生免疫应答以达到预防疾病的作用。DNA疫苗免疫反应主要有两个途径，携带编码抗原基因的重组载体在进入到宿主体内后，被细胞摄入，在真核启动子的作用下在细胞内转录并表达，一部分经过加工被抗原提呈细胞识别，从而激活T淋巴细胞分化成效应细胞，激发机体产生细胞免疫应答；另一方面表达的目的基因被B细胞等一系列的抗原提呈细胞所识别，刺激B细胞转化为浆细胞并产生针对DNA疫苗编码抗原的特异性抗体，激发体液免疫应答。因此，DNA疫苗作为第3代新型疫苗，不仅能够诱导体液免疫应答，而且能够诱导细胞免疫应答，具有免疫效果好、临床应用方便等优点。近年来，DNA疫苗已是国内外研究的热点，有些学者已对禽流感病毒、新城疫病毒、鸡马立克氏病病毒等禽类DNA疫苗进行了相关研究，目前国内哈尔滨兽医研究所研制的禽流感(H5亚型)DNA疫苗即将上市。