[发明专利]一种水溶性胶原的提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医用材料技术领域，特别涉及一种水溶性胶原的提取方法。

背景技术

胶原种类较多，常见类型为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅴ型和Ⅺ型，胶原因具有良好的生物相容性、可生物降解性以及生物活性，而广泛应用于食品、保健品、医用生物材料、组织工程、化妆品等领域。在医学领域中，胶原由于具有低免疫原性、纤维的再形成性、机械性能高和生物可降解性等优点，先后制成了医用胶原海绵、膜性生物补片、人工皮肤、美容填充植入剂、化妆品等。

目前胶原提取方法提出的胶原溶解性多为酸溶或碱溶，这给制备适合人体需要的中性生物材料的制备带来不小的麻烦。因此需要一种能在不破坏胶原原有三螺旋结构的情况下，能溶解于水的胶原。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种水溶性胶原的提取方法，能够保证完整的三股螺旋结构的情况下去除末端肽，且通过此方法制备的胶原能溶解于水。技术方案如下：

本发明提供了一种水溶性胶原的提取方法，包括以下步骤，

先对富含III型胶原的组织进行切片；

再将切片组织清洗浸泡在0.1%~40%(W/V)的碱溶液中，浸泡0.5~24h。清洗至PH为5~8后生理盐水浸泡约0.5-48h，沥去多余水分，2~8℃组织捣碎后分散进酶解液中，2~40℃环境酶解1~72h；酶解完毕后调PH值至7~13，2-40℃静置2~24h；30~150目滤网过滤，去除未酶解物。20%-50%(W/V)盐溶液盐析，收集固形物，截留分子量为4000~8000的透析袋透析，去除多余离子和杂质，获得多型胶原，最后将多型胶原混合物分散至水中，调PH值至1~5，30~150目滤网过滤，去除析出物，将滤液盐析后透析，得目的胶原。

在本发明的一种优选实施方式中，所述富含III型胶原的组织为海参、小牛皮、胎牛皮、小猪皮、胎猪皮的一种或几种；小牛皮、小猪皮动物年龄在0~3个月。

在本发明的一种优选实施方式中，所述浸泡用碱溶液的质量分数为0.1%~40%(W/V)。

在本发明的一种优选实施方式中，所述浸泡用碱溶液的溶质为氢氧化钠、碳酸氢钠、柠檬酸钠中的一种或几种；PH为8~14。

在本发明的一种优选实施方式中，所述生理盐水溶质为氯化钠，浓度为0.7~0.9%。

在本发明的一种优选实施方式中，所述酶解液为酸性蛋白酶，效价为1:1500~1:12000，酸性蛋白酶：组织切片为1:50~1:1000(W/W);酶解液PH值为2~6。

在本发明的一种优选实施方式中，所述盐析用盐溶液的溶质为氯化钠、硫酸钠、硫酸铵、氯化钾、氯化钙中的一种或几种，浓度为20%~50%(W/V)。

在本发明的一种优选实施方式中，所述首次盐析前待盐析物的PH为7~13，再次盐析前盐析物的PH为1~5；调PH所用碱液为氢氧化钠溶液、碳酸氢钠溶液、柠檬酸钠溶液中的一种或几种；调PH所用酸液为盐酸溶液、柠檬酸溶液、硫酸溶液、磷酸、醋酸溶液的一种或几种，碱液浓度为0.01~5mol/L,酸液浓度为0.01~10mol/L。

在本发明的一种优选实施方式中，在对动物组织进行胶原提取之前，先对所述组织进行预处理；所述预处理为用水对组织进行反复冲洗，之后切片，再用质量分数为0.05%~20%醋酸氯己定溶液浸泡0.5~24h，再用水反复冲洗。

在本发明的一种优选实施方式中，所述切片为冷冻切片。

具体实施方式

需要说明的是，本发明所使用的水均为医药行业所用的纯化水或注射用水，满足药典标准。

试剂和仪器

试剂均市售可得。

实施例1

选取新鲜的小牛皮组织0.5kg，水清洗至无肉眼可见异物；用剪刀剔除脂肪，水洗后，-20℃冷冻过夜；切片机切片，切片厚度约1mm，备用；

称取100g切片，浸泡在0.05%的醋酸氯己定溶液中浸泡0.5h，纯化水浸泡清洗5次，沥去多余水分备用。再将切片组织清洗浸泡在0.3%(W/V)的碳酸钠溶液中，浸泡6h。纯化水清洗至PH为8，然后用0.7%生理盐水浸泡约2h，沥去多余水分，2~8℃组织捣碎；

配制酶解液，按酸性蛋白酶：组织切片为1:150的比例称取酸性蛋白酶，蛋白酶效价为1:3000，溶解到摩尔浓度为0.02mol/L的4000ml盐酸溶液中，搅拌均匀。调溶液PH为4。

将捣碎组织分散进酶解液中，最终定容到5000ml。4℃环境酶解72h；酶解完毕后，氢氧化钠溶液调PH值至13，4℃静置10h；