[发明专利]一种高效的农杆菌介导的铁皮石斛遗传转化方法

权利要求书

1.一种高效的农杆菌介导的铁皮石斛遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)农杆菌的活化培养

挑取农杆菌转化子于液体培养基中，置于26-28℃，180-200r/min条件下活化，然后吸取培养液置于新的液体培养基中，置于26-28℃，180-200r/min条件下扩大培养，培养至OD600＝0.7-0.9，离心，收集菌体；其中，液体培养基包括：1％酵母提取物、1％胰蛋白胨、0.5％氯化钠、20mg/L利福平、50mg/L卡那霉素和50mg/L庆大霉素；其中，农杆菌为GV3101；

(2)浸染液的制备

将步骤(1)所得菌体加入MS液体培养基中，置于冰上使菌体完全溶于培养基中，再用MS液体培养基调节菌液至OD600＝0.4-0.8，然后加入100μmol/L乙酰丁香酮和0.001％Triton-100，摇匀；

(3)超声处理与浸染

将铁皮石斛种子诱导分化出原球茎，对原球茎进行扩大培养，然后挑选生长状态良好，颜色呈嫩绿色，质地均匀且较为松散的原球茎置于300W，40KHz条件下超声处理1min，然后浸入浸染液中，于28℃，50r/min条件下浸染30min；其中，扩大培养基为MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂4.8g/L+马铃薯20g/L+活性炭0.2g/L；

(4)共培养

浸染结束后，倒掉浸染液，用滤纸吸干原球茎上多余浸染液，然后将原球茎转移至共培养基上，进行暗培养；其中，共培养基为MS+蔗糖30g/L+琼脂4.8g/L+马铃薯20g/L，灭菌后再加入100μmol/L乙酰丁香酮；

(5)筛选

将共培养后的原球茎用无菌水冲洗4-5次，再用浓度为480-520mg/L的头孢溶液清洗1-2min，倒掉溶液，将原球茎用滤纸吸干水分，置于筛选培养基中培养，培养温度为22-25℃，光照强度为1800-2000lx，光照时间为14h/天，将存活的原球茎接种至新配制的筛选培养基中培养至长出新的原球茎；其中，筛选培养基为MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂4.8g/L+马铃薯20g/L，灭菌后添加头孢500mg/L+潮霉素20mg/L；

(6)植株再生

将筛选得到的新原球茎接种于不含潮霉素的筛选培养基中培养，待分化出芽后转入生根培养基中培养至获得完整植株；其中，生根培养基为MS+IBA 1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂4.8g/L+马铃薯20g/L。

2.根据权利要求1所述的高效的农杆菌介导的铁皮石斛遗传转化方法，其特征在于，步骤(2)中用MS液体培养基调节菌液至OD600＝0.6。

3.根据权利要求1所述的高效的农杆菌介导的铁皮石斛遗传转化方法，其特征在于，步骤(4)中置于20℃暗培养4天。