[发明专利]一种高效的农杆菌介导的铁皮石斛遗传转化方法

说明书

本发明提供了一种高效的农杆菌介导的铁皮石斛遗传转化方法，包括以下步骤：(1)农杆菌的活化培养；(2)浸染液的制备：将步骤(1)所得菌体加入MS液体培养基中，置于冰上使菌体完全溶于培养基中，再用MS液体培养基调节菌液至OD600＝0.4‑0.8，然后加入100μmol/L乙酰丁香酮(AS)和0.001％‑0.01％Triton‑100，摇匀；(3)超声处理与浸染：280‑320W，36‑45KHz条件下超声处理1‑3min；(4)共培养；(5)筛选；(6)植株再生。该转化系统完善，铁皮石斛原球茎的存活率高，经过各步骤及参数的优化，转化得到优良的抗性植株且转化率高，阳性转化率高达69.7％。

技术领域

本发明属于植物转基因技术领域，具体涉及一种高效的农杆菌介导的铁皮石斛遗传转化方法。

背景技术

铁皮石斛作为一种集观赏和药用价值于一身的重要中药材，主要分布于我国云南、贵州、浙江、四川等地。其含有石斛多糖、石斛碱、氨基酸等多种生物活性成分，味甘，性微寒，属补益药中的补阴药；具有滋阴润肺、生津益胃、清热止咳等功效。但由于其对生长环境要求特殊，多生长于高温多湿的热带、亚热带高山绝岭、悬崖峭壁之间，生长缓慢、自身繁殖能力极低。在人们长期掠夺式采挖与生存条件的破坏下，野生资源濒临灭绝，药材价格不断攀升。而现阶段有的杂交育种、选择育种、诱变育种以及组织育苗、温室或大棚进行后期培育的人工栽培方式由于其生产周期长、育种效率低、产量低、多糖含量不高等原因无法满足市场的需求。并且铁皮石斛资源品质不一、市场缺乏具优良性状的植株，存在如病虫害严重、难于控制开花以及花色花形不丰富等问题。利用转基因技术不仅能上调植物有益成分表达水平，还能增强其抗逆性和抗病虫能力，同时还能控制其生长发育进程，以利市场所需。

农杆菌介导法是利用农杆菌作为媒介进行基因转化的一种方法，与其他转基因方法相比，农杆菌转化方法有着明显的优势：转基因多是单拷贝或低拷贝数插入，并且优先插入转录活性区域；转化效率高，简单有效。并且随着人们对农杆菌介导转化法机理认识的深入，转化方法也不断得到改进。但是目前针对铁皮石斛这一重要中药材，一套农杆菌介导的系统完善且高效的转基因方法还尚未建立。

发明内容

针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种高效的农杆菌介导的铁皮石斛遗传转化方法，可有效解决现有技术中农杆菌介导的铁皮石斛遗传转化系统不完善，转化效率不高的问题。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种高效的农杆菌介导的铁皮石斛遗传转化方法，包括以下步骤：

(1)农杆菌的活化培养

挑取农杆菌转化子于液体培养基中，置于26-28℃，180-200r/min条件下活化，然后吸取培养液置于新的液体培养基中，置于26-28℃，180-200r/min条件下扩大培养，培养至OD600＝0.7-0.9，离心，收集菌体；其中，液体培养基包括：1％酵母提取物、1％胰蛋白胨、0.5％氯化钠、20mg/L利福平、50mg/L卡那霉素和50mg/L庆大霉素；

(2)浸染液的制备

将步骤(1)所得菌体加入MS液体培养基中，置于冰上使菌体完全溶于培养基中，再用MS液体培养基调节菌液至OD600＝0.4-0.8，然后加入100μmol/L乙酰丁香酮(AS)和0.001％-0.01％Triton-100，摇匀；

(3)超声处理与浸染