[发明专利]一种抗生素替代品氧化酶的制备方法

权利要求书

1.一种抗生素替代品氧化酶的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）葡萄糖氧化酶天然产菌株的基因的选育：利用微生物菌种选育技术和菌种定向选育技术，选育出葡萄糖氧化酶基因来源的野生型菌株，并在在YPD平板上进行筛选，取孢子制成孢子悬液，利用微生物菌种选育技术获得一株葡萄糖氧化酶突变株GOD－AN1312；

（2）诱变基因的克隆：将上述步骤（1）中筛选获得的葡萄糖氧化酶突变株GOD－AN1312的DNA为模板，PCR扩增获取葡萄糖氧化酶基因，得到的重组表达载体命名为Gegod-pPIC9K；

（3）含葡萄糖氧化酶基因工程菌构建：将上述步骤（2）中重组表达载体Gegod-pPIC9K采用BglⅡ进行线性化，线性化后的重组载体电击转化毕赤酵母GS115，电转化后涂布于含G418的YPD平板上进行筛选，筛选获得葡萄糖氧化酶发酵水平最高的工程菌Gegod-pPIC9K-GS115；

（4）葡萄糖氧化酶工程菌株的发酵培养及后处理：采用筛选获得的葡萄糖氧化酶重组菌株Gegod-pPIC9K-GS115进行高密度液体发酵培养，发酵结束后，发酵液可通过陶瓷膜或超滤膜进行后处理，复配载体进行喷雾干燥制得葡萄糖氧化酶成品。

2.根据权利要求1所述的一种抗生素替代品氧化酶的制备方法，其特征在于：所述步骤（4）中发酵酶活可达到1500U/mL左右的发酵水平。

3.根据权利要求1所述的一种抗生素替代品氧化酶的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中得到的重组表达载体Gegod-pPIC9K基因全长1755bp，编码584个氨基酸。

4.根据权利要求1所述的一种抗生素替代品氧化酶的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中葡萄糖氧化酶突变株GOD－AN1312具有耐温、pH范围宽、高活性的性能。

5.根据权利要求1所述的一种抗生素替代品氧化酶的制备方法，其特征在于：所述步骤（4）中发酵周期为7天。

6.根据权利要求1所述的一种抗生素替代品氧化酶的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中微生物菌种选育技术包括等离子体（ARTP）、紫外线、硫酸二乙酯（DES）进行单独及复合诱变处理其中的任意一种进行单独或复合诱变处理，筛选获得一株葡萄糖氧化酶突变株。