[发明专利]一种抗生素替代品氧化酶的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种氧化酶的制备方法，特备是一种抗生素替代品氧化酶的制备方法。

背景技术

随着畜牧业的快速发展，饲料中抗生素的使用已经成为畜牧业可持续、健康发展的关键问题。抗生素在畜牧领域的滥用，直接导致了耐药性、毒副作用、环境污染等问题，已经引起了世界各国的高度重视，更为严重的是抗生素在动物产品中的残留，对人类食品安全构成了严重的威胁。随着社会不的断进步，人们对食品和环境质量的要求越来越高，近几年来的大量研究证明，在畜禽饲料中长期且大量使用抗生素作为饲料添加剂存在着许多弊端，然而我国是一个发展中国家，生产力发展水平不高，因此很快完全禁止在畜禽饲料中使用抗生素目前来说是不现实的，抗生素替代品已经成为行业发展研究的的重要关注点，开发绿色、高效、无污染的饲料添加剂已经成为未来畜牧业健康发展的关键。酶制剂可作为抗生素替代方案的一个产品，已经被业界广泛关注。在饲料中添加酶制剂，可以直接补充内源酶的不足、促进饲料营养物质的消化，也可以间接提高机体免疫力、减少粪便排放、降低环境污染等。但传统酶制剂主要是直接补充体内营养性消化酶不足，间接去除饲料中的抗营养物质或者增加动物内原酶的分泌，不能直接作为抗生素替代品添加到饲料中杀灭细菌、调节肠道微生物菌群结构，提高动物的抗病能力和免疫能力。

葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase,GOD)是一种需氧脱氢酶，其系统名称为β－D－葡萄糖氧化还原酶 ( EC1.1.3.4)。葡萄糖氧化酶通常与过氧化氢酶组成一个氧化还原酶系统。葡萄糖氧化酶在分子氧的存在下，专一地氧化葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢，同时消耗氧气，而过氧化氢则分解生成水。葡萄糖氧化酶因其天然、无毒副作用而作为食品工业中一种重要的工业用酶，广泛用于葡萄酒、啤酒、果汁、奶粉等食品脱氧、面粉改良、防止食品褐变等方面。

葡萄糖氧化酶的作用产物为有机酸和过氧化氢，应用于饲料行业，能够替代部分抗生素或降低抗生素使用量，具有脱氧、杀菌的作用； 能够提高机体的免疫力并可促进机体生长，不会产生菌体抗药性或药物残留。作为一种新型饲料酶制剂，GOD的生理功能主要表现在以下几个方面：GOD 在进入动物胃肠道后以葡萄糖作为酶解底物，生成葡萄糖酸和过氧化氢，其中葡萄糖酸内酯可以自发水解成葡萄糖酸，具有酸化剂相似的作用；过氧化氢具有广谱杀菌作用，可以起到抑制大肠杆菌、沙门氏菌等致病微生物生长繁殖的作用；GOD 催化葡萄糖生成的葡萄糖酸可在肠道内发挥酸化剂和微生态制剂的双重作用，可使胃内食糜pH值降低，从而创造酸性环境，激活胃蛋白酶，有利于蛋白质、矿物质、维生素等营养成分的消化吸收，促进益生菌的增殖； 而有益菌大量增殖会形成微生态竞争优势，增强其他消化酶的生物活性，改善肠道菌群，促进肠道蠕动，提高营养物质的利用率，从而提高饲料转化效率；GOD在肠道消耗肠道内的氧气，造成厌氧环境，对预防和解除霉菌毒素中毒有很好的效果，可以促进动物消化道健康，提高动物对饲粮的消化利用；处于应激或病理状态的动物会产生大量自由基，当自由基超过机体自身的清除能力时就会破坏肠道上皮细胞。添加了GOD的畜禽饲料可以清除这些自由基，因为GOD 具有氧化还原作用，能保护肠道上皮细胞的完整性，阻止大量病原菌的入侵，提高免疫力，促进动物健康快速生长；GOD可消耗饲料中的氧气，氧气的消耗不仅抑制了微生物的生长，还减少了饲料营养的损失，同时能防止饲料中的油脂酸败变质，起到防霉剂和抗氧化剂的双重作用，从而改善饲料品质，延长饲料保质期。

发明内容

针对上述提出的问题，本发明提供了一种抗生素替代品氧化酶的制备方法，葡萄糖氧化酶作为一种新型的绿色、环保高效的饲料添加剂用于饲料中可减少抗生素的使用或者部分替代抗生素，广泛使用将为我们的绿色养殖的领域，其技术方案如下：

一种抗生素替代品氧化酶的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）葡萄糖氧化酶天然产菌株的基因的选育：

利用微生物菌种选育技术和菌种定向选育技术，选育出葡萄糖氧化酶基因来源的野生型菌株，并在在YPD平板上进行筛选，取孢子制成孢子悬液，利用微生物菌种选育技术获得一株葡萄糖氧化酶突变株GOD－AN1312；

（2）诱变基因的克隆：

将上述步骤（1）中筛选获得的葡萄糖氧化酶突变株GOD－AN1312的DNA为模板，PCR扩增获取葡萄糖氧化酶基因，得到的重组表达载体命名为Gegod-pPIC9K；

（3）含葡萄糖氧化酶基因工程菌构建：