[发明专利]一种利那洛肽的纯化方法

说明书

技术领域

本发明属于药物化学技术领域，具体涉及一种利那洛肽的纯化方法。

背景技术

便秘是指排便次数太少，或排便不畅、费力、困难、粪便干结且量少的一种消化道常见症状。多数慢性便秘患者表现为排便困难，粪便干结，数天甚至1周才排便一次，排便时可有左腹痉挛性痛与下坠感，部分病人诉口苦、食欲减退、腹胀、下腹不适、排气多或有头晕、头痛、疲乏等神经官能症状，但一般都不重。伴有剧烈腹痛、呕吐或便血者，则应考虑急性肠道阻塞引起的便秘。一般体检常可在降结肠或乙状结肠部位触及痉挛的肠管或粪块，但在排便后则消失。肠梗阻者则常有腹胀、腹痛、肠型及肠蠕动波。

利那洛肽（Linaclotide）是由美国Ironwood公司研发的一种鸟苷酸环化酶激动剂，于2012年8月30日获得美国FDA批准上市，商品名为Linzess。该药为胶囊剂，主要用于治疗便秘肠易激综合征(IBS-C)和慢性特发性便秘(CIC)，是首个具有此种作用机制的治疗便秘的多肽药物。

利那洛肽的分子结构是一个由14个氨基酸构成的短肽，序列为Cys-Cys-Glu-Tyr-Cys-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Thr-OH(1-6),(2-10),(5-13)-tris(disulfide)。该药物形态为白色至灰白色无定型的粉末，微溶于水和生理盐水。利那洛肽的分子结构为

。

分子中多对二硫键的存在给利那洛肽的纯化带来了较大困难，体现在以下几个方面：首先在合成利那洛肽时，会产生多种二硫键错配的杂质，这类杂质与产品很难分离，导致最终产品纯度低；其次由于存在多对二硫键，利那洛肽在立体结构上与一般多肽差异较大，常用的分离介质很难得到高纯度的产品；最后在产品生产过程中容易产生较多的多聚体，是产品的主要杂质之一，本身极不稳定，严重影响利那洛肽的色泽、含量及安全性。

中国发明专利CN105153284A提供了一种反相液相色谱梯度洗脱分离纯化的方法，CN103848893A提供了一种多孔石墨碳固定相结合含有立体选择剂环糊精流动相的反相液相色谱分离纯化的方法，这两种方法均在高效液相色谱体系中直接引入高盐的粗肽溶液，不利于长期稳定地获得纯肽产品。另外，在使用反相高效液相色谱法进行利那洛肽的纯化时，该分子中存在的多对二硫键会导致其纯化效果不理想，产品中的多聚体等杂质不易除去，影响产品的纯度和含量。

发明内容

针对上述现有技术的问题，本发明提供了一种利那洛肽的纯化工艺，通过离子交换色谱法，采用阴离子交换柱为分离介质，除去粗肽中存在的大量杂质，结合高效液相色谱进一步脱盐及转醋酸盐处理，能够很好地解决上述问题，保证设备能够长期、稳定、高效地制备获得高纯度的利那洛肽，适合工业化生产。

为实现上述技术目的，本发明提供一种利那洛肽的纯化方法，包括以下步骤：

1）将利那洛肽粗品加入纯净水中溶解得到利那洛肽溶液；

2）采用离子交换色谱法对利那洛肽溶液进行纯化，所述离子交换色谱法以阴离子交换柱为固定相，以Tris-HCl缓冲液为流动相A，以含有NaCl的Tris-HCl缓冲液为流动相B进行梯度洗脱，收集洗脱液；

3）采用高效液相色谱法对步骤2所得洗脱液进行脱盐及转醋酸盐处理，所述高效液相色谱法以C18柱为分离介质，步骤2所得洗脱液上样后，以乙酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B进行梯度洗脱，洗脱液经过冻干获得利那洛肽纯品。

步骤2中所述的利那洛肽溶液上样前经过0.22μm的PVDF膜过滤处理。

步骤2中所述的阴离子交换柱填料优选为SOURCE 15Q或Q-SepharoseFast Flow，但不限于这两种树脂。

步骤2中所述的阴离子交换柱填料最优选为SOURCE 15Q。

步骤2中所述的梯度洗脱，洗脱程序为流速0.5mL/min，在30 min内，流动相B的百分比为0~50%，待样品出峰后将流动相B比例调至100%。

步骤2中所述的流动相A为pH8.2~8.8的Tris-HCl缓冲液，其浓度为80~120 mmol/L。

步骤2中所述的流动相A优选为pH8.5的100 mmol/L Tris-HCl缓冲液。

步骤2中所述的流动相B为含有0.8~1.2 mol/L NaCl的pH8.2~8.8Tris-HCl缓冲液。

步骤2中所述的流动相B优选为含有1 mol/L NaCl的pH8.5Tris-HCl缓冲液。