[发明专利]一种烟草玻璃化愈伤组织和不定芽去玻璃化的方法

说明书

本发明属于生物技术领域，具体是一种烟草玻璃化愈伤组织和不定芽去玻璃化的方法，其特征是：将烟草组织培养过程中产生的玻璃化愈伤组织和不定芽在超净工作台内与正常组织分离开来，转移至空置的无菌组培瓶中，盖上瓶盖，置于光照培养箱（与正常组培条件一致）中进行饥饿处理1‑7天。待玻璃化组织恢复正常状态后，转移至分化培养基（愈伤组织）或伸长培养基（不定芽）中继续培养。应用本技术可以使烟草组织培养过程中产生的玻璃化愈伤组织或不定芽去玻璃化，再经继代培养可以形成正常的再生植株。本发明的优点在于：采用了无培养基的空瓶饥饿培养方法，无需增加任何培养成分，也不需要增加其他专用设备，操作简便，效果显著。

技术领域

本发明涉及一种烟草玻璃化愈伤组织和/或不定芽（两个对象都是适用）的去玻璃化方法，属于生物技术领域。应用该方法可以使烟草组织培养过程中产生的玻璃化愈伤组织或不定芽去玻璃化，并继续正常分化或伸长，最终形成完整植株。

背景技术

烟草属于管状花科目，茄科一年生或有限多年生草本植物，目前已经发现的烟属有66个种。传统上烟草是一种重要的经济作物，在国民经济中具有重要的作用，同时也是植物学科中重要的模式物种。自第一株转基因烟草问世以来，凭借较强的细胞再生能力以及组织培养和遗传转化的易操作性，烟草成为生物技术研究领域的最为活跃的研究材料之一。在医药工程领域，利用烟草作为生物反应器，已经被广泛用于生产烟草基因工程药物、烟草药用蛋白、烟草抗体和烟草疫苗等等。目前已经有很多关于烟草组织培养以及转基因的报道，但玻璃化是外植体在组织培养过程中常见的现象，属于植物组织培养三大难题之一。烟草组织培养过程中玻璃化问题也十分严峻，亟待解决。

玻璃化现象是植物组织培养过程中特有的一种生理性病变，指在植物组织培养过程中，部分试管苗出现生长异常，组织呈现透明或半透明的水渍状，芽苗矮小肿胀失绿，叶片皱缩成纵向卷伸，脆弱易碎，又称过度水化现象。玻璃化组织常表现出分化能力低，难以增殖成芽，也难以生根成苗。目前玻璃化形成机理研究主要集中在水势过高的影响、生长调节剂平衡问题和矿质元素平衡供应问题三个方面，普遍认为是培养环境中各方面因子的共同作用导致植物组织新陈代谢紊乱，从而造成玻璃化现象的出现。现有解决办法主要有降低6-BA浓度和增加培养固化剂（琼脂或植物凝胶）的浓度，但这些办法都不能完全杜绝玻璃化现象的发生，也不能挽救玻璃化组织。

发明内容

本发明的目的正是基于上述现有技术状况而提供一种促使玻璃化的烟草愈伤组织和不定芽去玻璃化的方法。该方法简单易行，操作方便，能够有效促使玻璃化的烟草愈伤组织和不定芽去玻璃化，效果显著。原玻璃化的烟草愈伤组织或不定芽经过该方法处理后，可以继续正常分化或伸长，最终形成完整植株。不需要增加额外成本就可促使玻璃化烟草愈伤组织和不定芽逆转成为正常组织。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种烟草玻璃化愈伤组织和不定芽去玻璃化的方法，包括以下步骤：

(1) 烟草玻璃化愈伤组织和不定芽处理：当正常培养的分化培养基上出现玻璃化的烟草愈伤组织或不定芽时，在超净台内将玻璃化部分与正常组织分离开来，如果玻璃化愈伤组织体积较大，应用无菌镊子分成适宜大小，并从培养基上取出，转移至灭菌的空置的干燥组培瓶内，密封瓶口。置于正常光照培养箱中1-7天，直至玻璃化组织恢复正常状态，期间若组培瓶内水分过多，可以更换组培瓶；

（2）处理后的愈伤组织及不定芽培养：将步骤（1）处理后恢复正常状态的烟草愈伤组织或不定芽在超净台内转移至分化培养基或伸长培养基上继代培养，5-8天后，原玻璃化烟草愈伤组织或不定芽即可正常分化或伸长；

（3）如果经过步骤（2）培养处理的去玻璃化烟草愈伤组织和不定芽在继代培养过程再次出现玻璃化迹象，重复步骤（1）和（2）。

在本发明中，所述正常光照培养箱的条件为：相对湿度60%，光照16 h/28 ℃，黑暗8 h/25℃，光强4 Lx。