[发明专利]PEDV JS2008株全长感染性cDNA的构建方法及应用

权利要求书

1.一种构建PEDV JS2008株全长感染性cDNA的方法，包括如下步骤：

（1）以PEDV JS2008株病毒总RNA的反转录产物为模板，采用引物A-1-F和A-4997-R扩增PEDV-A片段，采用引物B-4971-F和B-11100-R扩增PEDV-B片段，采用引物C-11073-F和C-16216-R扩增PEDV-C片段，采用引物D-16194-F和D-19726-R扩增PEDV-D片段，采用引物E-19702-F和E-24860-R扩增PEDV-E片段，采用引物F-24832-F和F-27954-R扩增PEDV-F片段；

（2）将步骤（1）PCR扩增获得的6片段，分别插入载体pSMART中，得到插入了PEDV-A片段的重组载体pS-A、插入了PEDV-B片段的重组载体pS-B、插入了PEDV-C片段的重组载体pS-C、插入了PEDV-D片段的重组载体pS-D、插入了PEDV-E片段的重组载体pS-E、插入了PEDV-F片段的重组载体pS-F；

（3）将重组载体pS-B内PEDV-B片段、重组载体pS-D内PEDV-D片段、重组载体pS-F内PEDV-F片段中的内切酶PflmI酶切位点进行沉默突变，以消除上述片段内部多余的PflmI酶切位点，分别得到重组载体pS-mB、pS-mD和pS-mF；

（4）将重组载体pS-A使用XbaI和PflmI进行双酶切，将重组载体pS-mB、pS-C、pS-mD和pS-E使用PflmI进行单酶切，将重组载体pS-mF使用PflmI和EcoRV进行双酶切；回收各重组载体酶切后的cDNA片段，连接后得到所述PEDV JS2008株全长感染性cDNA；所述A-1-F的序列为SEQ ID NO:1，A-4997-R的序列为SEQ ID NO:2，B-4971-F的序列为SEQ ID NO:3，B-11100-R的序列为SEQ ID NO:4，C-11073-F的序列为SEQ ID NO:5，C-16216-R的序列为SEQID NO:6，D-16194-F的序列为SEQ ID NO:7，D-19726-R的序列为SEQ ID NO:8，E-19702-F的序列为SEQ ID NO:9，E-24860-R的序列为SEQ ID NO:10，F-24832-F的序列为SEQ ID NO:11，F-27954-R的序列为SEQ ID NO:12。

2.根据权利要求1所述构建PEDV JS2008株全长感染性cDNA的方法，其特征在于将pS-B内PEDV-B片段采用如下方法进行沉默突变：以重组质粒pS-B为模板，采用引物6577-A/G-F和6577-A/G-R进行PCR扩增，回收扩增产物；回收的扩增产物在重组酶的催化下进行重组，从而将PEDV-B片段中的内切酶PflmI酶切位点进行沉默突变，得到重组载体pS-mB；6577-A/G-F的序列为SEQ ID NO:13，6577-A/G-R的序列为SEQ ID NO:14。

3.根据权利要求2所述构建PEDV JS2008株全长感染性cDNA的方法，其特征在于将pS-D内PEDV-D片段采用如下方法进行沉默突变：以重组质粒pS-D为模板，采用引物18027-A/G-F和 18027-A/G-R进行PCR扩增，回收扩增产物；回收的扩增产物在重组酶的催化下进行重组，从而将PEDV-D片段中的内切酶PflmI酶切位点进行沉默突变，得到重组载体pS-mD；18027-A/G-F的序列为SEQ ID NO:15，和18027-A/G-R的序列为SEQ ID NO:16。

4.根据权利要求3所述构建PEDV JS2008株全长感染性cDNA的方法，其特征在于将pS-F内PEDV-F片段采用如下方法进行沉默突变：以重组质粒pS-F为模板，采用引物25997-A/G-F和25997-A/G-R进行PCR扩增，回收扩增产物；回收的扩增产物在重组酶的催化下进行重组，从而将PEDV-F片段中的内切酶PflmI酶切位点进行沉默突变，得到重组载体pS-mF；25997-A/G-F的序列为SEQ ID NO:17，和25997-A/G-R的序列为SEQ ID NO:18。

5.权利要求1-4之一所述方法构建得到的PEDV JS2008株全长感染性cDNA。

6.权利要求5所述PEDV JS2008株全长感染性cDNA在拯救猪流行性腹泻病毒中的应用，其特征在于包括如下步骤：

（1）以PEDV JS2008株病毒总RNA的反转录产物为模板，采用引物N-F和N-R进行PCR扩增，得到N基因cDNA片段；N-F的序列为SEQ ID NO:19，和N-R的序列为SEQ ID NO:20；

（2）将JS2008株全长感染性cDNA和N基因片段分别采用体外转录试剂盒进行体外转录，获得全长RNA和N基因cDNA的转录物；

（3）将步骤（2）获得的全长RNA和N基因cDNA的转录物共转染Vero细胞，使用电穿孔仪ECM630进行电转化，条件为175V、50μF，3次脉冲，得到拯救后的病毒。